斑点免疫金银染色法

斑点免疫金银染色法

斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS）

1984年，Moeremans等将斑点酶联免疫吸附法（dot-ELISA）与免疫金银染色法相结合，建立了固相载体上的斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS）。 基本原理

蛋白质抗原通过直接点样或转移电泳吸附在硝酸纤维素膜（NC膜）上，与特异性抗体反应后，在滴加（或浸入）胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的粉红色斑点，称为斑点免疫金染色（dot-IGS）。此反应可再提高银显色液增强，即斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS）。 试剂及材料 （1）NC膜

（2）20mol/L，pH7.6 PBS （3）BSA

（4）定影液：20%硫代硫酸钠。 （5）电泳仪和电转仪 （6）其它试剂同上 操作方法

（1）用微量加样器在NC膜上直接点样1-2ml（若抗原含量少，可重复点样），或经转移电泳将抗原吸附在NC膜上，自然干燥； （2）将点样后的NC膜浸入含5%BSA和0.05% NaN3的20mol/L，pH7.6 PBS内，37℃，30min，以封闭未饱和的蛋白质结合位点； （3）用含0.1%BSA的TBS洗三次，每次5min；滴加适当稀释的一抗(1-2mg/ml，用含0.1%BSA和正常羊或兔血清的TBS稀释)，阴性对照用稀释液代替抗体，在室温下，反应2h；

（4）用含0.1%BSA的TBS洗三次，每次5min后，将NC膜浸入金标二抗溶液中（金标抗体用

含0.4%明胶和0.1%BSA的TBS适当稀释）。反应时间视金标抗体的稀释度而定：一般1：25稀释（OD520nm值约为0.2），反应时间为2h；1：100-1：200稀释（OD520nm值约为0.005），反应时间为16h；

（5）TBS冲洗，即可观察结果。此过程为dot-IGS。

（6）需要是可继续进行银显色反应，行dot-IGSS：将金标抗体染色后的NC膜，用TBS洗三次，每次5min，再用蒸馏水洗涤两次以去除Cl-，浸入0.2mol/L，pH3.5枸橼酸缓冲液内2min；

（7）移入银显色液中，避光显色5-10min后，再移入定影液中，定影5min； （8）自来水冲洗，自然干燥； 结果观察

dot-IGS：在NC膜上呈粉红色；dot-IGSS：在NC膜上呈棕黑色。