实验六 生物氧化与电子传递

实验六 生物氧化与电子传递（3学时）

一实验目的与要求 1. 掌握电子在电子传递链中的传递过程；

2. 了解体外实验中研究电子传递链的方法。

二实验原理

生物氧化过程中代谢物脱下的氢由NAD+ 或FAD接受生成还原型NADH或FADH2，再经一系列电子传递体传递，最后与氧结合生成水。这些存在于线粒体内膜上的氧化还原酶及其辅酶依次排列，顺序地起传递电子或电子和质子的作用，称为电子传递链或呼吸链。

在体内，代谢中间产物琥珀酸在线粒体琥珀酸脱氢酶（辅酶FAD）的作用下脱氢氧化生成延胡索酸，脱下的氢使FAD还原成FADH2，再经电子传递链传递，即FADH2→Q→细胞色素（b→c1→c→aa3），最后与氧结合生成水。

在体外实验中，组织细胞生物氧化生成琥珀酸的量可采用在琥珀酸脱氢时伴有颜色变化的化合物作氢受体来研究。

本实验以2，6-二氯酚锭酚（DPI）为氢受体，蓝色的DPI从还原型黄素蛋白（FADH2）接受电子，生成无色的还原型DPI·2H，蓝色消失，其反应过程如下：

琥珀酸+FAD→延胡索酸+ FADH2

DPI（蓝色）+ FADH2→DPI·2H（无色）+FAD

根据褪色时间可测定生物氧化过程中各代谢物与琥珀酸之间在代谢途径中的距离。 三、试剂及材料

磷酸钾缓冲溶液（PBS，50mmol/L，pH7.4）：0.2mol/L磷酸二氢钾溶液500ml和0.2mol/L氢氧化钠溶液395ml混合加水至2000ml。

猪心，2，6-二氯酚锭酚（1.5mmol/LPBS），葡萄糖溶液（90mmol/LPBS），琥珀酸溶液（90mmol/LPBS），乳酸溶液（90mmol/LPBS），NAD+（5mmol/L磷酸盐缓冲溶液）。 四、仪器设备

绞肉机，纱布，细砂，研钵，冰浴，恒温水浴。 五、操作方法

1. 心肌提取液的制备

称取绞碎的心肌糜3g，置250ml烧杯中，加冰冷的去离子水200ml，搅拌1min，静置1min，小心倾去水层，同法洗涤3次后，以细纱布过滤并轻轻挤压除去过多液体。将肉糜转移至冰冷的研钵中，加等量细砂和PBS5ml，在冰浴中研磨至糊状，再加PBS15ml，抽提（至少5min），双层纱布过滤，滤液收集于试管，置冰浴中备用。 2. 底物的氧化

取6支试管编号，按下表依次加入各试剂（单位ml）

管号 DPI 葡萄糖溶液 琥珀酸溶液 乳酸溶液 NAD+ PBS 1 0.5 0.5 — — 0.5 0.5 2 0.5 0.5 — — — 1.0 3 0.5 — 0.5 — 0.5 0.5 4 0.5 — 0.5 — — 1.0 5 0.5 — — 0.5 0.5 0.5 6 0.5 — — 0.5 — 1.0 将试管摇匀后于37℃中保温5min，加已经37℃水浴预保温5分钟的心肌提取液各1ml，混匀并继续保温。 3. 观察

观察各管颜色变化，记录各管褪色时间，30min不褪色者记为不褪色。分析实验结果所

说明的问题。 六、注意事项

1. 无色（还原型）DPI·2H与氧接触可重新氧化成蓝色的（氧化型）DPI，所以观察本实验结果时切勿振摇试管。

2. 体外实验亦可用甲烯蓝作为受氢体，再类似实验条件下蓝色的甲烯蓝（氧化型）受氢还原成无色甲烯蓝（还原型）。 七、思考题

1. 名词解释：电子传递链；氧化磷酸化作用；解偶联作用；高能化合物 2. 实验结果记录及分析 3. 讨论下列问题：

常见的呼吸链电子传递抑制剂有哪些？它们的作用机制是什么？

实验七 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量（4学时）

一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的实验原理，掌握相应的实验技术。 二、实验原理

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N–甲叉双丙烯酰胺（Methylence-bisacry-lamide，简称Bis）在催化剂和加速剂的作用下聚合交联形成的具有分子筛效应的三维网状结构凝胶。凡以此凝胶为支持物的电泳均称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）。凝胶筛孔大小、机械强度和透明度等物理参数，主要取决于凝胶浓度（T%）及交联度（C%），随着这两个参数的改变，可获得对待测分子进行分离、分辨的最适孔径。

T%=[(丙烯酰胺g + 甲叉双丙烯酰胺g)/总体积]×100

C%=[甲叉双丙烯酰胺g/(丙烯酰胺g + 甲叉双丙烯酰胺g)]×100

丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类。在连续系统中缓冲溶液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场的作用下主要靠电荷及分子筛效应得以分离；而在不连续系统中，不仅具有前两种效应，还具有浓缩效应，使电泳具有良好的清晰度和分辨率。

电泳时样品的浓缩效应主要由以下原因产生：（1）凝胶孔径的不连续。在不连续的PAGE中，电泳凝胶由上下两层不同pH、不同孔径的浓缩胶和分离胶组成，在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔的浓缩胶中泳动的速度快，当进入小孔分离胶时，其泳动过程受阻，因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的这种不连续性造成样品位移受阻而压缩成很窄的区带。（2）缓冲体系离子成分及pH值的不连续性。在Tris-甘氨酸缓冲体系中，各胶层中均含有HCl，

-HCl在任何pH溶液体系中均容易离解出Cl，它在电场中迁移率最大；甘氨酸等电点为6.0，

-在pH6.8的浓缩胶中，离解度很低，仅有0.1%~1%的NH2CH2COO，因而在电场中的迁移速度很慢；大部分蛋白质pI在5.0左右，在此电泳环境中都以负离子形式存在。通电后，这三种负离子在浓缩胶中都向正极移动而且它们的泳动率按mdach > mpap > mqaq排序（有效迁移率等于迁移率m与离解度a的乘积）。于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被压缩成极窄的区带。（3）是由电位梯度的不连续性所至。电泳开始后，由于Cl_-的迁移率最大，很快超过蛋白质，因此在快离子后面，形成一个离子浓度低的电导区，由此产生一个高的电位梯度，使蛋白质和慢甘氨酸离子在快离子后面加速移动，当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后，由于蛋白质的有效迁移率正好介于快、慢离子之间而被浓缩形成一狭小的区带。

当样品进入分离胶后，凝胶pH变为8.8，此时甘氨酸解离度大大增加，其有效迁移率

也因此加大，并超过所有蛋白质分子。这样，快慢离子的界面（由溴酚蓝指示剂标记）总是跑在被分离的蛋白质样品之前，不再存在不连续的高电势梯度区域。于是，蛋白质样品在一个均一的电势梯度和均一的pH条件下，通过凝胶的分子筛作用，根据各种蛋白质所带的净电荷不同，具有不同迁移率而达到分离目的。

垂直平板电泳凝胶是在两块垂直放置、间隔几个毫米的平行玻璃中进行的，所得的是垂直平板状的凝胶。垂直平板电泳有以下优点：一系列样品能在同一块凝胶板上进行，显色条件也相同；平板表面大，有利于凝胶冷却；易于进行光密度扫描测定。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是聚丙烯酰胺凝胶电泳的一种特殊形式。实验证明，在蛋白质溶液中加入十二烷基硫酸钠（SDS）这阴离子表面活性剂和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质–SDS复合物。大约每克蛋白质可结合1.4克SDS，蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷量远远超过了它原有的电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间原有电荷的差别。同时，SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的变化，使它们在水溶液中的形状近似于长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度均为1.8mm，而长轴则随蛋白质的相对分子量成正比的变化。

这样的蛋白质–SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，仅取决蛋白质分子量的大小。故可根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所做的标准

曲线，求出未知物的分子量。 三、试剂与仪器

（一）试剂（所用水为重蒸水）

1．30%单位胶储备液（Acr:Bis=29:1）

称58g丙烯酰胺（Acr）溶于180mL双蒸水，再加入2g甲叉双丙烯酰胺（Bis），溶解后定容至200mL，过滤备用。

2．分离胶缓冲液（pH8.8，3mol/L Tris-HCl） 称取36.33g Tris溶于80mL双蒸水中，在pH计上用HCl调pH至8.8，然后定容至100mL。 3．浓缩胶缓冲液（pH6.8，1mol/L Tris-HCl） 称12.11g Tris溶于80mL双蒸水中，在pH计上用HCl调pH至6.8，加水定容至100mL。 4．10% SDS：称取10g SDS，在65℃下用水溶解并定溶至100mL。 5．10%过硫酸铵（AP，聚合用催化剂）

称5g AP溶解于50mL双蒸水中，最好临用之前新鲜配制。也可置于4℃冰箱中避光保存，7天后重配。

6． 10% N，N，N，N–四甲基乙二胺（TEMED）（聚合用加速剂） 移取0.1mL TEMED稀释至1.0mL。置于4℃保存。 7．Tris-Gly电极缓冲溶液：称取7.5g Tris盐和36g甘氨酸用水溶解，再加入10%SDS 25mL，用水定容至500mL，备用。临用时稀释5倍。 8．50mmol / L Tris-HCl (pH6.8)缓冲溶液 称取0.606g Tris溶于80mL双蒸水，在pH计上用HCl调pH至6.8，然后加水至100mL。 9．加样缓冲溶液：吸取50mmol / L Tris-HCl (pH6.8)缓冲溶液3.2mL、10%SDS 溶液11.5mL、 β-巯基乙醇2.5mL、溴酚蓝2mg以及甘油5 mL，用水溶解并定容至50mL。 10．染色液

称取0.5g考马斯亮蓝R–250溶于甲醇和冰醋酸混合液（80mL/20mL）中，过滤备用。 11．脱色液

取150mL甲醇与50mL冰醋酸混溶，加双蒸水至500mL。 12．3%琼脂溶液。

13．标准分子量蛋白（电泳专用试剂）。

（二）仪器

1、直流稳压稳流电泳仪，电流100mA，电压400V—500V。 2、夹芯式垂直电泳槽，DYYⅢ 2A型，1.0mm梳槽。 四、操作方法 （一）电泳槽安装

夹芯式垂直电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两电极槽中间夹有一个由凹形硅胶框，长短玻璃板及样品槽模板组成（如图所示）。电泳槽分上贮槽（白金电极面对短玻璃板）、下贮槽（白金电极面对长玻璃板），回纹状玻璃管用于冷凝。两电泳槽与凝胶模间靠贮液槽螺钉固定。

夹心垂直电泳槽示意图 凝胶模示意图

1、导线接头；2、下电极缓冲液槽； 1、样品槽定位模扳；2、长玻璃板； 3、凹型橡胶板；4、样品槽模板； 3、短玻璃板；4、凹型橡胶框。 5、固定螺丝；6、上电极缓冲液槽； 7、冷凝系统。

图1 垂直板电泳槽结构示意图

1．组装前各部件应做彻底清洗，尤其是长短玻璃及凹形带槽橡胶框，须用少许洗衣 粉彻底清洗，晾干后才能使用。

2．把长短玻璃分别插入相应的凹形橡胶框，注意手指不要接触胶面的玻璃板。

3．用点滴管或进样枪，把已经融化的琼脂密封长、短玻璃板的间隙，琼脂以渗入长、 短两玻璃键间隙的高度1.0cm为宜，可略抬起胶框的一端在琼脂末凝固之前排去琼脂胶层的气泡。而后垂直放置胶框，让琼脂完全凝固。

4．把带正极的电泳槽有机玻璃板仰放于台面，将已经用琼脂密封好的玻璃板凝胶 模，以长玻璃板面对正极的方式，平放于玻璃板上方，然后把带有负极的另一侧电泳槽有机玻璃板按螺丝销钉装好，并以对角线的方式逐渐旋紧螺丝帽，松紧程度以电泳槽不渗漏电极缓冲液而样品槽梳子又能够方便插入为宜。 （二）灌胶 1、配胶

由于SDS电泳分离不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于所形成SDS—蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。如凝胶浓度太大，孔径太小，电泳时样品分子不能进入凝胶。如凝胶浓度太小，孔径太大，则样品中各种蛋白质分子均随着凝胶缓冲液流向前推进，而不能得以很好地分离。因此实验中可根据分析样品的分子量大小选择合适的凝胶配比。不同浓度分离胶配比参考如下：

表 不连续缓冲系统电泳中不同网孔凝胶溶液配方参考表 试剂 分离胶凝胶浓度 （12.5 T%） 分离胶凝胶浓度 （10 T%） 分离胶凝胶浓度 （7.2 T%） 浓缩胶凝胶浓度 （4 T%）

分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 单体胶储备液 10%SDS 重蒸水 10%过硫酸铵 TEMED٭ 总体积 3.15mL / 10 mL 0.25 mL 11.2 mL 0.2 mL 40μL 25 mL 3.15 mL / 8.5 mL 0.25 mL 12.7 mL 0.2 mL 40μL 25 mL 3.15mL / 6.0 mL 0.25 mL 15.2 mL 0.2 mL 40μL 25 mL / 2.5mL 2.7 mL 0.25 mL 14.2 mL 0.2 mL 40μL 20 mL ٭此溶液在灌胶前最后加入，以避免胶体凝固无法灌胶。 2、灌胶

a分离胶制备：将配制好的分离胶，连续缓慢地沿长玻璃板板壁注入凝胶模，直至胶液的高度达到低玻璃板板面2/3左右，用注射器小心流加入2 cm左右高度的双蒸水覆盖胶面，其加水速度应控制在不破坏胶层分度。约60min左右后，当凝胶与水层间出现折射率不同的分层面时，表明凝胶聚合完成。倾去胶层蒸馏水，再用双蒸水洗涤胶面，以除去未聚合胶液，并用滤纸吸干多余的水。

b浓缩胶置备：用微量的未加TEMED的浓缩胶洗涤分离胶面一次，倾去洗涤用的浓缩胶液，用滤纸吸干多余的胶液。然后将配好的浓缩胶连续缓慢加到已聚合的分离胶的上方，直至距离短玻璃板上缘约1mm处为止，随后将样品槽梳子轻轻插入浓缩胶内。待凝胶聚合后，小心拔出槽梳板，注意不要弄断或弄裂胶层。用长针头轻而有序地将每个凹形样品槽修饰整理，加双蒸水清洗槽坑，最后用针筒抽干凹槽内的双蒸水。

将稀释5倍的Tris–Gly电极缓冲液，倒入电泳仪上、下贮槽中，缓冲液高度以浸泡短玻璃板0.5cm以上为宜，即可准备加样。 （三）样品处理与上样 1、电泳样品前处理

（1）标准蛋白样处理：按购置标准蛋白样品说明书操作，取一定体积标准蛋白样品溶液于1.5mL离心管，加入适量加样缓冲液，混匀，在100℃沸水中浴中加热3~5min，取出冷却后上样。若上样液中浑浊，离心后备用。

（2）待分析蛋白样品前处理：根据待测样品蛋白含量，加入适量的加样缓冲溶液溶解，使样品浓度约为0.5~2mg/mL，混匀，按上述方法加热处理，冷却，离心后备用。处理后的样品可放在4℃的冰箱中短期保存，-20℃冰箱中保存6个月，使用前在仍需在沸水浴中加热3~5min后上样。 2、加样

向样品槽加入20~25μL样品，一般以上样体积≤样品槽总体积2/3为宜。如样品槽出现气泡，可用注射器剔除。加样时把装有样液注射器的针头小心伸进样品槽内，并尽量接近其底部，切勿捅穿胶层，轻轻推动注射器将样液注入样品槽底部，由于加样缓冲液中含有甘油，从而使样品液的比重增加并可自动沉将于样品槽的底部。 由于两端样品槽的样点易产生边缘效应影响，影响分子量分布的分析结果，所以凝胶板两端的样品槽一般不作点样用，仅注入溴酚蓝指示液跟踪样品在电场中的泳动情况。 （四）电泳

正确联接电泳槽与电泳仪的正负极，接通冷凝水，开启电泳仪开关，采用稳流电泳。首先把电压调整电位器向右旋转6~7圈，使电泳过程电压有足够的上升区间，调整电流旋钮将电流调至25mA后开始电泳。当溴酚蓝指示液泳动迁移至距离橡胶框前沿约1.5cm时，将电流回调至零，关闭电源及冷却水，电泳结束。 （五）凝胶剥离

旋松电泳槽固定螺丝，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢小铲撬离短玻璃板，弃去浓缩胶，小心剥离分离胶，并在凝胶片基线处切下一角作为加样基线标记，用双蒸水略冲胶面。

（六）染色与脱色

把胶片移入染色液中，染色6小时以上，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，更换脱色液直到电泳区带清晰为止。

五、结果计算与分析

由电泳实验结果，记录标准蛋白质分子以及样品蛋白分子相对迁移加样端距离(cm)、溴酚蓝染料相对迁移加样端距离(cm)。 根据下式计算各标准蛋白质分子的相对迁移率： 相对迁移率 =

标准蛋白质分子迁移距离(cm)

染料迁移距离(cm)以标准蛋白质相对分子质量的对数（lgMw）为纵坐标，标准蛋白质分子的相对迁移率为横坐标做标准曲线，根据样品蛋白的相对迁移率从标准曲线中求出其相对分子量。 注意：记录溴酚蓝染料相对迁移加样端距离(cm)应在凝胶脱色前完成。

六、问题讨论

1．Acr及Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，使用时应予注意。

Acr和Bis的贮液在保存过程中，会由于水解作用而产生丙烯酸和NH3，虽4℃置于棕色瓶内保存可有效防止水解作用，但也只能贮存1~2个月。可通过pH值（4.9~5.2）来判断检查试剂是否失效。

2．由于玻璃板表面的不洁净，可能会导致电泳时发生凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥 离，产生气泡或滑胶；剥胶时胶板极易断裂。所以所使用的电泳槽组件务必彻底清洗。 为保证样品槽平整，槽梳子使用前必须用95%乙醇 洗净，风干后才使用。

3．用琼脂密封长短玻璃间隙及灌胶时，胶层不能包裹有气泡，以免影响系统导电性。 4．为防止电泳后区带拖尾，影响分辨率，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的 样品可经脱盐后再作电泳分析。

5．电泳分析时，不同分子量的样品应选用不同的分离胶浓度。蛋白质分子量在 65~200KDa可选用7.5%；21~200KDa，可选用10%凝胶；14~100KDa，可选用12%凝胶；6.5~200KDa，可选用15%凝胶。浓缩胶浓度均可选4%。操作时，若不知分子量也可先选用7.5%分离胶浓度尝试，因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳，均可取得较满意的电泳效果，而后根据分离情况选择适宜的浓度进一步取得理想的分离效果。

七、思考题

a.系中，样品在浓缩胶中是怎样被压缩成“层”的？

b.液中甘油和溴酚蓝的作用是什么？可用何物代替甘油？ c.实验过程，做好电泳的关键步骤有哪些？

d.色液可否重新使用？应如何处理？处理时应注意什么问题？ e.缓冲液电泳后，能否重新使用，重新使用应做什么处理？

f.聚丙烯酰胺凝胶电泳与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点及适用范围。