微生物信号

微生物群体感应调节信号分子N-酰化高丝氨酸内酯研究进展

杨广超 020110027 生物化学与分子生物学

摘要：近10年来，小分子介导的微生物群体感应调节受到广泛关注。介导微生物群体感应调节的信号分子包括AIP、AI-2、DKPs、DPD、N-乙酰化高丝氨酸内酯(AHL)等，其中AHL成为研究热点，研究表明其具有潜在的抗菌、抗肿瘤、免疫抑制和诱导细胞凋亡等作用。目前对AHL介导微生物群体感应调节机制研究较多．而对于此类化合物的合成及其构效关系研究还处于初步阶段。下边就AHL类似物的群体感应调节机制、构效关系、生物合成和化学合成方法加以介绍。

关键字：体感应调节；N-酰化高丝氨酸内酯；作用机理；构效关系：化学与生物合成

N-Acylhomoserine lactones as microorganism quorum sensing

modulators research advances

Abstract：BacteriaI quorum sensing demonstrates the ability of bacteria to control gene expression through the minimal threshold stimulatory concentration of certain chemical called auto inducers, which are secreted by self and/or other bacterial Quorum sensing has been implicated in the control of bacterial behaviors such as the secretion of virulence factors, bilfilm formation, bioluminescence production, conjugation, sporulation and swarming motility. Micorganism quorum sensing mediated by small molecules, including AIP ,AI-2,DKPs,DPD and N-acyl honoserine lactones(AHL), has drawn wide attention in the last ten years. Especially the research on AHL has become a hot topic, alarge number of inducer

and so on. Much work has been done to explore the action mechanism of AHL to quorum sensing modulation, but it is remaining unclear. What’s more, researches on the synthesis and structure-activity relationship(SAR) of AHL are still on the preliminary stage. Therefore, this content summarizes the action mechanism SAR synthesis of AHL and the analogues, aiming to provide information helpful for new drug discovery and development.

Key words: quorum sensing modulations; N-acylhomoserine lactones; action mechanism; structure activity relationship; chemical and biological synthesis

微生物群体感应(quorum sensing, QS)是细菌根据群体中细胞密度变化来调控自身基因表达的一种群体行为。微生物通过合成和分泌信号分子监控着周围环境中自身或其他细菌的数量变化。当细菌生物膜中细菌的数量积聚增加到一定程度(域浓度)。信号分子便与细胞膜或细胞质中的受体结合，激活靶基因表达与基因编码酶。进而发出信号。改变和协调受体间行为．表现出诸如质粒的接合转移、生物膜与孢子形成、诱发生物荧光、产生毒力因子、胞外多糖形成等群体行为。从而实现单个微生物无法进行的某些生理功能和调节机。此外．微生物还可通过信号分子进行相互间的信息“交流”形成生物膜．进而提高微生物对过高或过低的pH、温度、压力以及抗生素等外界环境的抵抗力。介导微生物OS调节的信号分子包括自诱导多肽(AIP)、自诱导分子2(AI-2)、环二酮哌嗪(DKP)、4，5-二羟基-2，3-戊二酮(DPD)、N-酰化高丝氨酸内酯(AHL)等，其中AHL(图1)成为近10年研究的热点。研究表明其具有潜在的抗菌，抗肿瘤、免疫抑制和诱导细胞凋亡等作用。在医药学、农学和环境科学等方面的研究均取得一定进展。下边介绍AHL及其类似物的Qs调节机制、构效关系、生物合成和化学合成方法的研究进展。

1 N-酰化高丝氨酸内酯类似物群体感应调节机制

微生物产生的AHL含量与群体总数成正比，当微生物总数达到一定水平时．调节基因表达，释放毒力因子、形成生物膜和孢子、产生抗生素等。从而对人类的健康造成威胁，而对于共生菌，通过这一调节机制．与宿主达到更好的共生。

革兰阴性菌通过细胞质LuxR型受体(CviR)和膜基LuxN型受体检测环境中的AHL分子束调节QS(图2)．其中包含两种作用机制：(1)细胞质LuxR型受体检测胞内AHL分子．在胞内AHL分子浓度较低时没有与AHL分子结合的LuxR蛋白为不溶物并且容易发生降解。在AHL分子高浓度时，AHL分子结合LuxR型蛋白形成LuxR-AHL复合物，该复合物结台DNA，从而激活QS的靶基因。LuxN家族中两组分的膜基组氨酸激酶型蛋白与胞外的AHL分子结合，其自身磷酸化改变，从而使与DNA结合的转录因子磷酸化改变，促进QS基因表达，诱发生物荧光(图2右)。

AHL介导微生物Os调节机制较为复杂．不同的微生物介导的机制不同，从分子水平研究AHL与受体间的作用方式是目前研究的热点，一般作用机制如图3所示。

以铜绿假单胞菌为例，QS体系包括两条连续作用的信号通路。酶LasI产生OdDHL，其结合并激活LuxR的同系物LasR．LuxR的同系物是配体激活的转录调节剂，激活的LasR开启毒力因子基周和编码LuxR同系物的基因rhIR转录。RhIR结合第二个信号分子BHL，并开启另一个毒力因子基因的表达，两者同时作用产生毒力因子并形成生物膜．从而使宿主感染，从分子水平研究AHL类似物与受体间的作用方式．从而设计并合成阻断或激活信号通路的信号分子．发挥其生物活性。目前已经发现的抑制QS调节的方式有如下6种：(1)抑制信号分子的生物合成途径；(2)拮抗信号分子受体以及通路中的相关受体靶点；(3)使用与信号分子竞争性结合受体的分子；(4)酶催化的信号分子降解；(5)信号分子胞内外运输与分泌抑制；(6)使用阻断信号分子受体的抗体，其中后两种研究较少。因此QS体系是一个潜在的药物作用靶点。

2 N-酰化高丝氨酸内酯类似物构效关系研究

2．1免疫调节作用

研究发现侧链3位含氧的高丝氨酸内酯类似物(图4)抑制啮齿类动物和人类白细胞增殖和脂多糖(LPs)诱导的肿瘤坏死因子TNF的释放，并能调节促细胞分裂素诱导的人外周

血单核细胞的增殖。在TNF介导的免疫系统疾病如类风湿关节炎、l型糖尿病等疾病中。AHL抑制免疫调节的分子生物学基础正在研究中。通过初步的构效关系研究发现，侧链长度为C11~C14、侧链具有不饱和性和(或)侧链末端具有非极性取代基的AHL类似物，具有免疫抑制活性．而酰基侧链较短。具有B单元的AHL缺乏活性。侧链末端具有Br/OH取代或者具有不饱和基团时，活性保留；侧链末端具有-COOH/-COOMe活性降低；3位为O或OH取代的AHL具有最好的免疫抑制活性，而且二者活性相当；缺乏内酯环、具有极性取代基、手性中心不是L-构型时活性丧失。此外．分子的脂溶性对活性至关重要。

2．2抗肿瘤活性

也有研究发现。OdDHL(图5)下调胸腺嘧啶核苷酸合酶．选择性地作用于人类肿瘤细胞，提高氟尿嘧啶、紫杉醇对直肠癌、前列腺癌患者的疗效。PHLA(图5)抑制3种人癌细胞系(H630、H630-1和PC3)的结果表明，PHLA酰胺侧链长度短于8个C原子．无论3位氧化态如何均不具有活性：酰胺侧链长度介于10-14个C原子具有最好的抗肿瘤活性．3位羰基是活性必需基团，有利于进一步提高抗癌活性；侧链较短活性降低；D-PHLA无抗肿瘤活性：OdDHL消旋体活性只有L-OdDHL的50％。此外酰基侧链具有8-11碳原子时具有最好的QS调节作用。

2．3 OS调节作用：信号转导

研究表明AHL中的内酯环在生理条件下发生水解．且AHL同R蛋白的结合与羰基氧上的孤对电子有关。与内酯环中其他氧无关。以环酮代替内酯环，发现环酮类似物也具有QS调节作用。在酰基侧链末端引入苯环，保留了天然AHL的脂溶性，使PHLA能够自由扩散，到达作用靶点；酰基侧链长度为8-11个C原子时具有最好的活性。此外化合物N-己酰基高丝氨酸内酯作为紫色杆菌的天然信号分子，与化合物11联合使用时能够干扰紫色杆菌突变体CV026的QS系统，达到抗菌作用．高丝氨酸内酯类似物对化合物12-14的抗菌作用起到协同作用(图6)。

N-烷基和N-芳基取代的脲类似物(15-18)能够竞争性抑制3位含氧的己酰基高丝氨酸内酯(23)诱导的费氏弧菌生物荧光；N-丁基脲类似物抑制LuxR受体中ExpR蛋白N端结构域的二聚而显示拮抗活性：N-烷基脲类似物(18-19)中烷基链至少含有4个碳原子。且在烷基端含有苯环，具有较好的拮抗活性；构效关系研究发现。苯环上有CH3和-Cl等供电子基团取代时，活性提高，-CF3取代时对活性没有明显的影响；N-甲基化(18)时活性明显下降。内酯环中有双键时没有活性；拮抗活性与芳环与内酯环之间的距离有关；侧链中有额外的羰基时几乎没有活性；脲结构单元中羰基变成硫羰基时(19)，活性降低。且苯磺酰基高丝氨酸内酯似物(n=l-3)(20)也有类似的活性。

烷基(或烷基末端有苯环取代)取代的磺酰基高丝氨酸内酯类似物(21)通过抑制3位含

氧的己酰基高丝氨酸内酯而发挥抑制费氏弧菌产生生物荧光的作用．脂肪族类似物比末端有苯环取代的类似物具有更好的活性；分子模型研究发现。该类化合物通过扰乱配体与蛋白复合物之间的氢键而发挥拮抗作用。

豌豆根瘤菌信号分子及其异构体的全合成以及侧链的立体构型和内酯环立体构型对抗菌活性的影响．发现抑制活性相同时，需要的信号分子最低剂量分别是2S，

3’R:5-10ng;2R,3’R：50 ng;2S,3’R：1000 ng；2R，3’S：5000ng。侧链的立体结构比高丝氨酸内酯环的立体结构对生物学活性更重要,而2S,3’R构型的小细菌素(22)活性更高(图7)。

2．4诱导细胞凋亡作用

3-位含氧的十二酰基侧链的L-高丝氨酸内酯类似物具有诱导巨噬细胞P388Dl和U973细胞系凋亡作用,进一步的构效关系研究表明。此类化合物酰基侧链含氧位置(化合物24-26)以及L-高丝氨酸内酯结构单元是诱导细胞凋亡的必要单元，3位羰基在侧链其他位置时活性降低，内酯结构单元换成其他结构活性降低(化合物27-28)，酰基端带有疏水结构(化合物30-31)有利于提高活性，末端带有亲水性基团活性降低(化合物32)，内酯环为R构型时活性较高(化合物29)。此外3位含氧的酰基侧链长度对活性亦有一定影响，侧链延长活性提高(图8)。

3 N-酰化高丝氨酸内酯类似物的合成研究

AHL作为微生物QS调节的信号分子，在其群体行为如产生毒力因子、形成生物膜、诱发生物荧光以及根瘤固氮等中发挥重要的作用。已有较多的相关研究设计非天然的AHL来阻断或促进QS调节，但有效的AHL却较少，加之受体结构的特殊性，因此对QS信号分子设计和合成成为此领域的研究热点．合成AHL分子库可以更好的从分子水平研究微生物QS调节机制。

3．1生物合成法

AHL的生物合成过程一般是在LuxI同系物的作用下，S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)的氨基与酰基载体蛋白(ACP)结合的酰基衍生物相互作用，使SAM的氨基酰化，再发生分子内的亲核取代，失去一分子甲巯蛋氨酸，生成AHL(图9)。有报道表明在纯化的重组AHL合成酶TraI作用下，SAM与ACP结合的脂肪酰基衍生物(非脂肪族乙酰辅酶A衍生物)反应，合成AHL类似物。

3．2以乙酰乙酸叔丁酯为原料合成

通过对3位含氧的十二酰基-L-高丝氨酸内酯类似物的构效关系研究发现．酰基侧链末端含有疏水性基团时可提高巨噬细胞诱导凋亡作用。以乙酰乙酸叔丁酯为原料合成末端环丙基和苯基取代的高丝氨酸内酯类似物(图10)。

3．3丙二酸环亚异丙酯参与的合成

有报道称从橘树的嗜中温甲基杆菌中分离得到的(S)-N-(2E，7Z)-十四酰基二烯基高丝氨酸内酯的合成并确定了其绝对构型．对其抗菌活性进行了相关研究．其合成路线见图11。

微波辅助下合成苯乙酰型高丝氨酸内酯，该类化合物具有抗肿瘤活性，且可激活铜绿

假单胞菌QS信号通路。通过构效关系研究发现，3-oxo-12-苯基十四酰基-L-高丝氨酸内酯(n=9)具有最好的抗肿瘤活性和最低限度的激活QS信号通路，其合成路线见图12。

3．4以L-丝氨酸和L-蛋氨酸为原料合成

对AHL类似物的合成及其活性研究主要集中在酰基侧链的变化，对内酯环部分的结构修饰报道较少。对内酯环部分的结构修饰有助于提供LuxR受体与信号分子内酯环部分作用的相关信息，发现新型的QS信号调节分子。以L-丝氨酸和L-蛋氨酸为原料合成4位和3

位取代的AHL类似物。

L-丝氨酸在乙酰氯和甲醇作用下生成L-丝氨酸甲酯，后经过氨基的Cbz保护、羟基的磺酰化、碘代生成化合物53，化合物53在Zn的作用下生成有机锌试剂54，在Pd2(dba)3，催化下，与烯基溴作用生成化合物55．在经过氧化和分子内关环生成4位羟甲基取代的高丝氨酸内酯中间体56和57(图13)。

L-蛋氨酸(58)经过羧基甲基化。氨基Cbz保护和NaIO4。氧化生成化合物59，化合物59发生热消除生成烯基甘氨酸砷．在经过氧化和分子内关环生成3位羟基取代的高丝氨酸内酯62和63(图14)。

在正己酸羟基丁二酰亚胺酯作用下．Pd/C催化氢化一锅法生成化合物65，化合物硒在CuCl作用下与乙基异氰酸酯作用生成氨基甲酸酯内酯化合物硒(图15)。

3．5基于纤维素载体的合成法

采用基于纤维素载体的合成法每天可合成10～1000个苯乙酰基高丝氨酸内酯(PHL)和桂皮酰基高丝氨酸内酯类似物(CHL)，该类分子具有QS拮抗活性。此种方法具有操作简单，降低试剂使用量．纤维素载体便宜且可直接在载体上进行微生物活性实验等优点。

在1，1’-羰基二咪唑(CDI)和N-甲基咪唑(NMI)的作用下,纤维素载体与化合物67通过酯化反应生成化合物68，化合物68在DBU作用下脱去Fmoc保护基，游离的氨基与

各种苯乙酸和桂皮酸在DIC和HOBt作用下经酰化反应，生成化合物69，化合物69在三氟乙酸蒸气作用下，T,rt脱保护并环化，生成PHL和CHL(图16)。

3．6微波辅助的固相合成法

在微波辅助下利用固相合成法合成了4大类约90个AHL分子库，考察了分子中侧链的3位氧化态、侧链长度、侧链的芳香性、芳香性基团与内酯环间的距离、内酯环的立体构型、苯乙酰基侧链类似物以及各类不同的酰基侧链变化对分子的QS调节生物学活性的影响。与固液合成法相比。此法可得到纯度较高的AHL分子，适合用于构建AHL组合分子库，为QS的激动或拮抗活性测定提供大量的分子模型。

具体合成方法为：以氨基聚苯乙烯树脂(72)为固定相，在微波辅助下，以DIC为缩合剂与N-Fmoc保护的也．蛋氨酸(73)缩合，加热脱Fmoc保护，再在DIC作用下，与各种酸(75)、B酮酯(76)或磺酰氯(77)缩合，生成酰化树脂，再在CNBr的作用下与L-蛋氨酸的串联环化、裂解，最终生成AHL分子(图17)。

3．7不对称催化合成法

在K2PtCl4/CuCl2催化氧化体系下．在水相中以S-缬氨酸为底物。选择性激活缬氨酸r位C-H键，生成N-Boc保护的高丝氨酸内酯母核结构。该法具有较好的区域和立体选择性，产物消旋度低(<5％，5 h)(图18)。

以prophenol-Zn催化下生成的a-叠氮乙酸酯与亚胺的加成物作为手性源，采用不对称催化氢化法立体选择性地全合成了(2S，3’R，7’Z)-N-(3’-羟基-7’-十四酰基)高丝氨酸内酯(84)，该化合物具有很好的豇豆根瘤菌RBL5523的抑制活性。

具体合成方法如下：在(S，S)- prophenol和10mol％(Et)2Zn的催化作用下，N-Boc保护的呋喃亚胺(85)与a-叠氮乙酸乙酯(86)发生不对称加成生成化合物87，化合物87氢化还原得到化合物88。三氟乙酸脱Boc保护后．在臭氧作用下呋喃环氧化开环生成化合物89，最后在酸性条件下环化得到高丝氨酸内酯盐酸盐90。烷基磷盐92与苄氧戊醛91

通过wittig反应成Z-烯烃(Z/E=99：1),还原脱去苄基后通过DMP氧化得到化合物94。在SnCl2的催化作用下化合物94与a-叠氮乙酸乙酯反应生成酮酯95，在催化剂A的催化下，以HCOOH／Et3N作为氢的供体(选用2-丙醇/KOH体系作为氢的供体则产率很低)，立体选择性地得到化合96(59％，er=90：10)，化合物96在EDCI和HOBt作用下，与高丝氨酸内酯盐酸盐90缩合，最终得到目标化合物84。合成路线见图19。

4展望

目前,对于AHL的生物学活性研究方法还没有标准化,加强活性评价的标准化有助于对该类化合物的结构与活性之间的关系有更深入的了解,从分子水平研究该类化合物与受体间的作用方式可以更加清晰地了解QS调节机制，有利于进一步设计出活性更好的非天然

AHL类似物：尽管对于此类化合物的合成与结构修饰已有相关报道．但由于其合成路线复杂或所需的手性原料不易得到等缺点限制了其进一步的深入研究．对于酰基侧链的结构修饰报道较多。在内酯环部分的修饰较为少见．其中研究较多的S构型，而R构型缺乏相关研究。因此，新的合成方法和结构修饰以及从分子水平研究QS调节机制将成为今后研究的热点，QS信号通路将成为一个有效的药物作用靶点。

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