蔗糖酶

啤酒酵母中含有丰富的蔗糖酶，通常被当做提取蔗糖酶的重要材料。酶的纯化通常有五个阶段：材料的选择与预处理；细胞破碎；抽提；纯化；浓缩、干燥及保存。

一、蔗糖酶粗品的制备

1、自溶 称取40g新鲜的啤酒酵母放在250ml三角瓶中。然后分别加入1.2g乙酸钠细粉末、20ml甲苯。在35℃水浴中保温30min，并间隔片段震荡，此时会观察到菌体自溶的现象。此溶液为自溶液。

2、抽提及粗酶的制备 ⑴向自溶液中加入60ml无菌蒸馏水，于35℃保温过夜。 ⑵第二天，将自溶液于4000RPM(Rotatian Per Minute)×15min离心。 ⑶离心完成后，离心管内液体一般分为三层：下层透明，中层为变性蛋白质和块状粘稠物，上层为有几层。用吸管将最上层的甲苯吸去然后再用一药勺挡住中间块状粘稠物，倾斜离心管倒出上清液。弃去粘稠物。 ⑷此时，如果上清液中有少量悬浮物存在，可再离心一次（4000RPM×20min），如上清液已滤清，小心倒入250ml烧杯中，此溶液为无细胞抽提液，即粗酶液。 ⑸量出粗酶液的体积即VE1，记录，从中取出1ml置0～4℃保存，用于测定酶活力和蛋白质纯度及浓度，其余供下步继续纯化。

二、蔗糖酶的第一次分离 1、粗酶液pH值调节 将粗酶液E1，用10%的乙醇调其pH值至4.4～4.6之间（注意置冰浴上并在不断轻柔搅拌的情况下缓慢加入乙醇），并记录加入乙醇的体积。 2、32%饱和度乙醇的配置

按下面的公式计算出使粗酶液的乙醇浓度达到32%时所需乙醇体积。

X1 ＝0.32

V＋X1

X1为所需乙醇体积，V为E1和加入10%乙醇的总体积。按X1/0.95换算出所需95%乙醇的体积。

3、32%饱和度乙醇分离蔗糖酶

把粗酶液和量好预冷的95%乙醇分别放入冰浴中。

用一细长滴管将预冷的乙醇滴入粗酶中（滴与滴间不能连成线），同时用磁力搅拌器轻柔搅拌，注意一定不要使乙醇局部浓度过高，否则会引起酶变性失活。

在滴加乙醇的过程中，酶液逐渐变浑浊，滴加结束后，冰浴静置20min。 4000RPM×5min，上清转移到另一烧杯中待用，弃去沉淀。 4、47.5%饱和度乙醇的制备（步骤参照3） ⑴按前述方法，在离心后得到的蔗糖酶粗酶液中，继续补加乙醇使乙醇浓度为47.5%，冰浴静置30min。 ⑵4000RPM ×10min，弃去上清，得少量沉淀。 ⑶将沉淀用10ml，pH6.0,0.005mol/LPBS溶解。 ⑷装入自制的透析袋中，将透析袋放入盛有pH6.0,0.005mol/LPBS的烧杯中进行透析，时间为2～3h（中间更换一次透析液，并置冰箱中进行透析）。 ⑸透析后将透析酶液进行离心，4000RPM×5min，取上清，量体积VE2，并留1ml（0～4℃保存）待测酶活力及蛋白浓度及纯度，其余酶液上DEAE—Cellulose柱。

三、蔗糖酶的第一次纯化（DEAE—Cellulose层析柱） 1、DEAE—Cellulose处理 用浮选除去细部分，留下沉集部分，重复几次。然后用0.5mol/L的NaOH，水，0.5mol/LHCl，水，0.5mol/L的NaOH，水，0.5mol/LHCl，水，交替浸泡0.5～1h，HCl浸泡0.5h，每次抽滤后用水洗至中性。最后用0.005mol/L，pH6.0PBS平衡。

将平衡好的DEAE—Cellulose抽气，最后加0.005mol/L，pH6.0PBS使其体积比为1：1，待装柱时使用。 2、装柱

把柱子垂直固定好，将DEAE—Cellulose装柱，床高距柱顶2㎝为宜，使用起始缓冲液（0.005mol/L，pH6.0PBS）平衡流速调为4ml/5min，平衡（平衡体积为床体积的5倍以上为平衡好）。当平衡洗脱液流出后，调节核酸蛋白检测仪及记录仪，酶液检测一般选择的紫外波长为280nm，在0.05A时调零，而当调T%时，用调光量旋钮将其调至100.同时调整自动部分收集器的旋转方向和时间间隔，本实验以5min为间隔。 3、上样

将柱中多余的液体放出后，将样品（酶液）小心加到层析柱中，打开流速夹，使样品流入柱内，关闭恒流泵，在洗脱柱中加入洗脱液至一定的高度（方法如加样），然后加0.005mol/L，pH6.0PBS150ml洗柱，此流出液中不含我们所需要的酶，因此，可不比收集，但通常要隔几管检查是否酶活力的存在。同时观察核酸蛋白紫外检测仪上吸收值的变化，这时一般T%从100缓慢降低，幅度不大。记录仪上显示基本平行线，当有蛋白出现后，记录仪上会出现一个峰。 4、洗脱

待150mLPBS洗完后，改换含0.1mol/LNaCl的0.005mol/L，pH6.0PBS洗脱，流速不变，每5min收集一管。通常收集7～10管后，改换0.2mol/LNaCl的0.005mol/L，pH6.0PBS洗脱，使目标蛋白集中快速流出，收集至经检查无酶活力为止。 5、酶活力的检测 ⑴取血糖管若干支，编号，各加入2mL5%蔗糖（pH4.6），每间隔一管取0.05mL收集液，并制备一个空白对照管。 ⑵按先后顺序分别加入上述含2mL5%蔗糖的血糖管中混匀，置35℃水浴保温10min。 ⑶仍以先后顺序加入0.5mL 1mol/LNaOH,立即摇匀，使酶失活，反应终止。 ⑷加入1.5mL3,5—二硝基水杨酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，蒸馏水稀释至25mL刻度，用盐水瓶塞子塞住血糖管口，摇匀，直接目测，即可测定酶活力高峰范围。 ⑸对应酶活力出现高峰范围，合并酶液，量体积，即VE3，留1mLE3（0～4℃保存）用于待测酶活力及蛋白浓度及纯度，其余进行以下处理。 ⑹将E3装入透析袋中，做好标记，在pH6.0,0.005mol/LPBS中透析3h（置冰箱），然后用聚乙二醇8000（PEG）将酶液浓缩至2～3mL。

四、蔗糖酶的第二次纯化（分子筛层析） 1、凝胶的预处理

将选好的干凝胶慢慢倾入5～10倍的蒸馏水中，依凝胶溶胀所需要的时间进行充分浸泡，除去表面悬浮的小颗粒后，再用0.5mol/LNaON、0.5mol/LNaCl溶液在室温下浸泡0.5h，以抽滤法除去碱液，用蒸馏水洗至中性。 2、装柱及鉴定

取已处理好的Sephadex G-200（凝胶：PBS=1:1，V/V）适量，装入层析柱内。

3、凝胶柱的鉴定

采用色素法检测凝胶柱的质量，也可以将柱管朝光方向用眼睛观察，看是否均匀，是否有气泡。

4、柱平衡

用0.005mol/L，pH6.0PBS平衡，用恒流泵来调节流速保证流速在1mL/5min以内，并保持恒定。平衡体积为床体积的5倍以上为平衡好。 5、上样

与一般柱层析相同，将柱中多余的液体放出后，将样品小心加到凝胶柱上，打开流速夹，使样品流入柱内，然后加0.005mol/L，pH6.0PBS150ml洗脱。从加样后开始，每一管流出液均需要收集并检测酶活力。如果采用全自动部分收集住层析系统，通过恒流泵控制洗脱流速在1mL/5min以内。 6、洗脱

洗脱过程同离子交换层析一样，中间不用更换洗脱液。 7、酶活力的检测 ⑴取血糖管若干支，编号，各加入2mL5%蔗糖（pH4.6），每间隔一管取0.05mL收集液，并制备一个空白对照管。 ⑵按先后顺序分别加入上述含2mL5%蔗糖的血糖管中混匀，置35℃水浴保温10min。 ⑶仍以先后顺序加入0.5mL 1mol/LNaOH,立即摇匀，使酶失活，反应终止。 ⑷加入1.5mL3,5—二硝基水杨酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，蒸馏水稀释至25mL刻度，用盐水瓶塞子塞住血糖管口，摇匀，直接目测，即可测定酶活力高峰范围。 ⑸对应酶活力出现高峰范围，合并酶液，这时会出现两个酶活力高峰，通常中间会间隔几管，这是由于蔗糖酶会存在不同相对分子质量的同工酶所致。合并两个活力高峰的酶液，量体积，即VE4，留1mLE4（0～4℃保存）用于待测酶活力及蛋白浓度及纯度，其余进行以下处理。 ⑹将E4装入透析袋中，做好标记，在pH6.0,0.005mol/LPBS中透析3h（置冰箱），然后用聚乙二醇8000（PEG）将酶液浓缩至2～3mL。