姚攀;陈慧芝;李竹君;何瑞;杨锦芬;徐晖
【摘 要】旨在克隆穿心莲CPS的编码基因,并进行序列分析.通过RT-PCR和cDNA末端快速扩增的技术从穿心莲叶片中获得目的基因；并利用生物信息学的方法对其编码蛋白进行功能分析.结果显示,获得了全长2 499 bp的cDNA序列,编码一个833aa的蛋白.序列同源性比较表明,该蛋白与野甘草、咖啡等其他植物来源的CPS具有较高的同源性.保守功能结构域分析显示,该蛋白包含一个富含Asp残基的植物萜类合酶的共有保守功能域“DXDD”,归属于萜类生物合成酶Ⅰ类超级家族和顺式聚异戊二烯焦磷酸合酶超级家族.初步推测克隆得到了穿心莲CPS的编码基因(命名为ApCPS,GenBank登录号为JN216843.1). 【期刊名称】《生物技术通报》 【年(卷),期】2012(000)010 【总页数】7页(P156-162)
【关键词】穿心莲;穿心莲内酯;ent-焦磷酸古巴酯合成酶(CPS);基因克隆 【作 者】姚攀;陈慧芝;李竹君;何瑞;杨锦芬;徐晖
【作者单位】广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心,广州510006;岭南中药资源教育部重点实验室广州中医药大学,广州510006;广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心,广州510006;岭南中药资源教育部重点实验室广州中医药大学,广州510006;广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心,广州510006;岭南中药资源教育部重点实验室广州中医药大学,广州510006;广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心,广州510006;岭南中药资源教育部重点实验室广州中医药
大学,广州510006;广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心,广州510006;岭南中药资源教育部重点实验室广州中医药大学,广州510006;广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心,广州510006;岭南中药资源教育部重点实验室广州中医药大学,广州510006 【正文语种】中 文
萜类成分广泛存在于植物、真菌等生物体中，既包括了固醇、胡萝卜素等初级代谢产物，又包括了成千上万结构各异的次级代谢产物。萜类合酶是萜类成分生物合成的关键酶，萜类成分结构的丰富性与萜类合酶家族成员的多样性密不可分。自1992年开始有植物萜类合酶基因克隆的报道，迄今为止，已有超过200种的植物萜类合酶的cDNA被克隆，包括烟草、薄荷、番茄、丹参等多种植物的单萜合酶、倍半萜合酶、二萜合酶[1-6]。有趣的是，目前的相关研究显示，各种萜类合酶基因可能都是由一个双功能的编码贝克杉烯合酶的祖先基因（CPS/KS gene） 演变而来[7]。贝克杉烯合酶含有两个活性位点，其中位于N端的活性结构域带保守功能域“DXDD”，位于C端的活性结构域带保守功能域“DDXXD”，通过基因复制、功能丢失以及功能更新，形成了各种单功能或双功能的萜类合酶[7，8]。 穿心莲内酯类成分（Andrographolides）是常用大宗中药材穿心莲
[Andrographis paniculata （Burm.f.） Nees]的主要药效活性成分，是一类由十氢萘环合而成的对映半日花烷型（ent-labdane）二萜内酯[9，10]。焦磷酸香叶基香叶酯（GGPP）环合形成ent-焦磷酸古巴酯（ent-CPP）是穿心莲内酯生物合成的关键步骤，决定了穿心莲内酯的母核结构，而催化这个环合反应的二萜合酶——ent-柯巴基焦磷酸合酶（ent-copalyl diphosphate synthase，简称CPS），是影响穿心莲内酯生物合成的关键限速酶（图1）。Maison等[11]在对穿心莲（Andrographis paniculata Wall.ex Nees）的遗传多样性研究中发现了一个
CPS基因片段（GenBank登录号：AJ973129.1）。使用Blastx对该基因片段进行比对，发现该基因与野甘草、蓖麻、葡萄等多种植物的CPS基因具有较高同源性。
本研究根据已经公开的穿心莲CPS部分基因序列及其同源基因序列，采用简并引物逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）与cDNA末端快速扩增（RACE）相结合的方法，克隆穿心莲CPS基因的cDNA序列，并进行功能分析，旨在为深入研究该基因与穿心莲内酯类成分生物合成的相关性奠定基础。
1.1.1 植物材料 穿心莲植物采自广州中医药大学“华南药用植物资源库”迁地保护区，经广州中医药大学詹若挺研究员鉴定为爵床科植物穿心莲[Andrographis paniculata （Burm.f.） Nees]。于11、12月期间收集穿心莲的新鲜嫩叶，每次取0.1 g用于穿心莲叶总RNA的提取。
1.1.2 试剂 RNAisoTM Plus（总RNA提取试剂）、RNAisoTM - mate for Plant Tissue （植物总RNA提取辅助剂）、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Taq DNA聚合酶、Ex Taq Hot Start DNA 聚合酶、PrimeSTAR® HS DNA Polymerase、dNTPs、3'-Full RACE Core Set Ver.2.0、Agarose Gel DNA Purification Kit、pMD19-T Vector克隆载体，限制性内切酶均购自大连宝生物公司；iScript cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad，美国）；Power Taq DNA polymerase、2×Power Taq Plus PCR MasterMix（百泰克，北京）；Advantage®2 PCR Enzyme Systemd、SMARTerTM RACE cDNA
Amplifcation Kit（Clontech，美国）；pGEX-4T-3表达载体（GE，美国）；引物由上海生工生物技术服务有限公司和北京六合华大基因科技股份有限公司合成；测序由北京六合华大基因科技股份有限公司和上海英潍捷基Invitrogen公司完成；大肠杆菌E.coli DH5α菌株（本实验室保存）。
1.2.1 穿心莲CPS基因核心片段的扩增 将Gen-Bank中穿心莲CPS基因的部分序
列（登录号：AJ973129.1）以及其他已知CPS基因序列进行比对，用GeneFisher和CODEHOP v1.0设计一对简并引物apCPS_deF1和apCPS_R1（表1）。称取0.1 g穿心莲新鲜嫩叶在液氮中研磨，按照植物总RNA提取试剂盒说明书进行穿心莲总RNA的提取，并通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量[12]。以总RNA为模板，使用iScript cDNA Synthesis Kit进行反转录得到cDNA。以cDNA为模板，用引物apCPS_deF1和apCPS_R1进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃2 min；94℃ 30 s，53.7℃ 30 s，72℃ 50 s，36个循环；72℃ 5 min。对扩增产物回收后进行序列测定。并在NCBI上用BLASTn对测序结果进行比对，确定其是否为ApCPS基因片段。 1.2.2 穿心莲CPS基因3'端及5'端的克隆
1.2.2.1 RACE引物的设计 根据1.2.1项获得的核心片段和RACE试剂盒的引物设计要求，设计3'RACE的序列特异性引物：1st PCR的apCPS 3'GSP1和2nd PCR的apCPS 3'GSP2；5'RACE的序列特异性引物：apCPS 5'GSP1（表1）。 1.2.2.2 3'端及5'端的克隆与全长序列的拼接 3'-RACE：以穿心莲总RNA为模板，使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，再利用3'-Full RACE Core Set Ver.2.0，以引物对Outer Primer和apCPS 3'GSP1，Inner Primer和apCPS 3'GSP2进行嵌套PCR反应，退火温度为56℃。5'-RACE：以穿心莲总RNA为模板，5'-CDS Primer和SMARTer II A Oligonucleotide为引物，用SMARTerTM RACE Kit进行反转录，再以试剂盒中的UPM和apCPS 5'GSP1进行PCR扩增，退火温度为59℃。回收目的DNA，连接到pMD19-T克隆载体上，并进行测序。使用DNAMAN 5.2.9 Demo version软件将获得3'-末端和5'-末端与核心片段序列拼接，得到cDNA全长序列。
1.2.3 穿心莲CPS编码区的克隆 根据拼接获得的cDNA全长序列中的编码区设计引物apCPS sense和apCPS antisense（表2），以cDNA为模板，用Prime-
STARTM HS DNA Polymerase进行PCR，扩增编码区全长。PCR产物胶回收纯化，用BamHⅠ和SmaⅠ对进行双酶切，酶切产物纯化后连接到pGEX-4T-3载体上。筛选阳性克隆测序，检验编码区完整性。
1.2.4 生物信息学分析 用DNAsis for Windows Ver 2.1软件对基因的开放阅读框进行分析，翻译得到氨基酸序列。用GenBank中的Blastp对所得到的氨基酸序列进行同源分析。用iPSORT运算法则对蛋白进行亚细胞定位预测，SignalP 3.0 Server对氨基酸序列进行信号肽在线预测分析，用TMHMM Server v.2.0对氨基酸序列进行跨膜结构域预测分析。利用GenBank中的Blastp对氨基酸序列进行同源分析，利用保守功能域数据库（conserved domain database，CDD）进行蛋白保守功能域的在线预测[13]。用DNAMAN 5.2.9进行多重序列对比及系统进化分析。登陆 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt/，向GenBank提交cDNA序列。
从穿心莲新鲜嫩叶中提取总RNA，电泳结果（图2）显示，得到了较完整的RNA，28S和18S rRNA条带清晰，无DNA污染，可用于反转录。
使用核心片段扩增引物apCPS_deF1和apCPS_R1进行RT-PCR，获得约为420 bp的目的片段（图3）。取PCR产物送样测序，得到373 bp的序列。使用Blastn对该序列进行分析，与穿心莲CPS基因片段序列（登录号：AJ973129.1）一致性大于98%。
3'-RACE克隆得到约1 900 bp的片段（图4-a），测序得到含poly（A）的3'端序列，使用GenBank数据库中Blastx进行同源基因分析，结果表明，该序列与野甘草的CPS 3'端序列有较高的一致性（68%）。5'-RACE克隆得到约950 bp的片段（图4-b），测序得到960 bp，使用GenBank数据库中Blastx进行同源基因分析，结果表明，该序列与野甘草的CPS 5'端序列有较高的一致性（57%）。 将克隆得到的5'端序列、核心片段序列与3'端序列进行拼接，获得了全长cDNA
序列，共2 645 bp，包含5'端的非编码区、2 499 bp的开放阅读框和3'端的非编码区（包含polyA），命名为“ApCPS-2645”。开放阅读框编码832个氨基酸。
使用引物apCPS sense和apCPS antisense扩增得到的编码区片段（图4-c）经过酶切后连接到pGEX-4T-3载体上，筛选阳性重组子，测序得到2 631 bp的序列，命名为“ApCPS-2631”。使用ClustalW将ApCPS-2631与拼接全长序列ApCPS-2645进行比对，结果表明两条序列一致性为97%，在开放阅读框架内有两个碱基不同。
使用DNAsis对“ApCPS-2631”中编码区2 499 bp进行分析，翻译得到一个全长为832 aa的蛋白，分子量约为95.371 kD。亚细胞定位预测该蛋白N端包括一个30 aa的叶绿体转运肽。信号肽在线预测结果显示，信号肽可能区域位于N端45位氨基酸之前的序列。跨膜结构域在线预测结果显示，不具跨膜结构域，整个多肽链位于膜外（图5）。
将ApCPS-2631中编码区翻译得到的蛋白用Blastp进行比对。结果（表3）表明，该蛋白与多种植物来源的CPS具有较高的同源性，相似性介于70%-77%。 进一步使用DNAMAN构建系统进化树进行亲缘关系分析，结果（图6）显示，该编码蛋白与野甘草（S.dulcis）CPS蛋白的亲缘关系最近。
将克隆获得的编码蛋白与5种植物（野甘草、毛果杨、向日葵、豌豆和拟南芥）的CPS多重氨基酸序列对比（图6）显示，从第100位氨基酸以后，该蛋白序列中存在较多的保守区域，其中包括第715-717位之间的富含Asp残基的植物萜类合酶的共有保守功能域“DXDD”（图7黑框部分）。
CDD搜索发现，该编码蛋白的保守功能域主要为第40位氨基酸和第800位氨基酸之间的CPS保守区域（PLN02592），其中包括了若干个底物结合区域、一个底物-Mg2+结合区域、一个天冬氨酸富含区域、其他萜类环化或合成区域。基于
与已知蛋白活性位点的序列相似性，该蛋白归属于萜类生物合成酶I类超级家族和顺式聚异戊二烯焦磷酸合酶超级家族（图8）。
本研究利用同源克隆的方法从穿心莲叶片中克隆得到了全长2 499 bp的cDNA片段，编码832 aa。氨基酸序列分析表明，在第40-800位氨基酸之间为CPS的保守功能域，包含一个典型的植物萜类合酶共有保守功能域“DXDD”，但不含另一个共有保守功能域“DDXXD” [7]。亚细胞定位及信号肽在线预测显示该基因编码蛋白带N端信号肽，定位于叶绿体，行使催化功能，这与植物二萜合酶定位于质体中是一致的[7]。同源性比较证明，其与多种植物CPS具有较高的同源性。综合上述生物信息学分析结果，推断克隆得到的DNA片段是一个单功能CPS的编码基因，命名为ApCPS，将编码区序列提交到GenBank，获得序列登录号JN216843.1。
在研究过程中还发现，拼接的全长序列与直接克隆的cDNA序列在编码区内不完全一致，存在两个碱基的差异，从而导致在氨基酸C端有2个氨基酸的不同，其可能原因是DNA聚合酶在扩增过程中存在错误，因此以高保真酶扩增的全长cDNA片段测序结果（“ApCPS-2631”）为最后结果。此外，在RT-PCR反应中存在较多的非目的条带，分析其原因可能是该基因在穿心莲中存在同源基因。已有文献报道在多种植物中找到多个CPS基因[14]，如日本粳稻全基因组中存在4个CPS基因，其中OsCPS1与植物激素赤霉素合成相关，OsCPS2参与了非赤霉素类二萜的生物合成相关，OsCPSsyn与syn-半日花烷型的二萜合成相关[15，16]。穿心莲中CPS同源基因的存在情况如何，本研究克隆获得的ApCPS基因是否参与了次生代谢物穿心莲内酯的合成，均有待于更深入的分析和探讨。 萜类成分是一个庞大的天然产物家族，其生物合成及代谢调控一直是科学研究的热点。萜类成分也是中药发挥药效的主要物质基础之一，关于中药中萜类成分生物合成方面的研究也日益深入[17-19]，但目前尚未见对二萜类成分穿心莲内酯的生物
合成相关功能基因的研究报道。CPS是穿心莲内酯生物合成途径中起催化环合作用的关键酶，该基因的成功克隆为下一步进行ApCPS基因的表达和功能验证打下了基础，并为阐明穿心莲中穿心莲内酯的生物合成途径提供了重要的研究资料。 本研究利用RT-PCR与RACE相结合的方法从穿心莲叶片中克隆了CPS基因的cDNA片段，全长2 499 bp，编码832 aa，其编码蛋白产物归属于萜类生物合成酶I类超级家族和顺式聚异戊二烯焦磷酸合酶超级家族。
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