钙调素mRNA在烟草花药发育过程中的原位定位

研究简报

科　学　通　报

1998年10月

5　VermaDPS,ShoemakerRC.SoybeanGenetics,MolecularBiologyandBiotechnology.Wallingford:CABINTERNA2

TIONAL,1995

6　KeimP,DiersBW,OlsonTC,etal.RFLPMappinginsoybean:associationbetweenmarkerlociandvariationinquantita2

tivetraits.Genetics,1990,126:735～742

7　DiersBW,FehrW,KeimP,etal.RFLPanalysisofsoybeanseedproteinandoilcontent.TheorApplGenet,1992,83:

608～612

8　SkorupskaHT,ShoemakerRC,WarnerA,etal.Restrictionfragmentlengthpolymorphisminsoybeangermplasmofthe

SouthernUSA.CropSci,1993,33:1169～1176

9　LarkKG,WeisemannJM,MatthewsBF,etal.Ageneticmapofsoybean(GlycinemaxL.)usinganintraspecificcross

oftwocultivars:‘MinsoyandNoir1’.TheorApplGenet,1993,86:901～906

10　ShoemakerRC,SpechtJE.Integrationofthesoybeanmolecularandclassicalgeneticlinkagegroups.CropSci,1995,35:

436～446

(1998202223收稿,1998205212收修改稿)

钙调素mRNA在烟草花药发育过程中的原位定位陈绍荣　吕应堂　杨弘远

(武汉大学生命科学学院植物生殖生物学研究室,武汉430072)

摘要　利用RNA原位杂交技术,以地高辛标记的反义RNA为探针,研究了烟草花药发育过

程中钙调素mRNA时空分布特点.烟草花药各个不同发育阶段均有钙调素mRNA的分布,但表达水平有明显的时空差异.花药发育早期,钙调素mRNA表达很强,主要分布于表皮、绒毡层和药隔维管薄壁细胞等,尤其是即将进行减数分裂的小孢子母细胞核部位和减数分裂时期的染色体部位有较多的mRNA积累.随着花药的发育,药壁和花粉中的表达量逐渐减弱.到成熟花粉期,仅药壁表皮和维管薄壁细胞中仍有较强的阳性反应.结果暗示,烟草花药发育过程中钙调素mRNA的时空表达可能与细胞分裂、花粉发育和物质转运密切相关.

关键词　钙调素mRNA　烟草　花药　原位杂交

钙调素(CaM)作为钙(Ca2+)信号系统的重要成员之一,在调节植物生长发育过程中起着关键性作用[1].虽然钙调素在真核细胞中广泛分布,但在不同组织中的含量有很大的差异,并随细胞生理状态不同和环境或激素的刺激而发生明显的变化[2].研究钙调素表达水平在植物生长发育过程中的时空变化,对于探讨其作用机制有着重要意义.Jena等人[3]用Northern杂交检测到钙调素mRNA在马铃薯块茎形成过程中大量积累,Breton等人[4]也测得玉米胚胎发生过程中钙调素mRNA表达水平的变化,但对不同组织中mRNA表达的空间分布不能确定.RNA原位杂交技术能够从细胞水平精确定位基因表达产物的时空分布,在国际上已被广泛应用于植物发育生物学中基因表达调控研究[5],但尚未见有关花药发育过程中钙调素基因表达原位定位研究的报道.我们以地高辛(digoxigenin)标记的反义RNA为探针,研究了烟草花药发育过程中钙调素mRNA时空分布的特点及其生理意义.

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1　材料与方法

　　(1)材料.烟草(NicotianatabacumL.)小孢子母细胞、减数分裂、四分体、游离小孢子和成熟花粉等各个不同发育时期的花药用4%多聚甲醛固定,常规酒精系列脱水,石蜡切片,切片厚度10μm.

钙调素cDNA由Sasaki等人[6]从水稻中分离,日本NIAR(NationalInstituteofAgrobio2logicalResources)和STATF(InstituteofSocietyofTech-InnovationinAgriculture,ForestryandFisheries)水稻基因组研究计划(Japanesericegenomeresearchprogram,RGP)Nagamura博士

提供,长度为0.8kb,克隆在pBluescriptIISK+质粒中,克隆位点为SalⅠ/NotⅠ,两端分别有T7和T3RNA多聚酶起动子.按Sarmbrook等人[7]的方法转化、扩增和提取质粒,受体菌株为大肠杆菌TG1.

NotⅠ和SalⅠ内切酶、T3和T7多聚酶以及地高辛标记检测试剂等分别购自BM,Promega和Sigma公司.

(2)RNA原位杂交.按文献[8]的方法进行RNA原位杂交.质粒用salⅠ或NotⅠ内切

酶线性化后,前者用T3、后者用T7RNA多聚酶分别体外转录地高辛标记的反义RNA和有义RNA(对照).切片经预杂交处理后,用反义RNA和有义RNA探针分别作原位杂交.经洗涤,再用带有碱性磷酸化酶的抗地高辛抗体(anti-DIG-AP)做免疫反应,用氮蓝四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)显色,封片观察.有蓝紫色沉淀产生的为阳性反应.

2　结果

　　原位杂交结果显示,烟草花药从小孢子母细胞、减数分裂、四分体、游离小孢子到成熟花粉等各个不同发育阶段均有钙调素mRNA的分布,但表达水平和部位有明显的差异.用T7RNA多聚酶体外转录的钙调素有义RNA探针原位杂交,各个时期的切片除适量背景外均无

阳性反应(图1(j)).

小孢子母细胞时期,表皮、药室内壁、中层、环形细胞团(药室交界处,与裂药有关)、绒毡层和小孢子母细胞内均有很强的阳性反应,尤其是即将进行减数分裂的小孢子母细胞中细胞核部位有较多的mRNA积累(图1(a)).药隔尤其是其中的维管薄壁细胞也有较强的阳性反应.

小孢子母细胞减数分裂时期,药壁各层细胞中仍保持很强的阳性反应(图1(d)),药隔部位的表达量也没有改变.在减数分裂Ⅰ和减数分裂Ⅱ时期染色体部位有较多的mRNA积累,

(c)).前期的核消失和末期的核重构部位也有明使染色体不经常规染色而清晰可见(图1(b)、显的mRNA积累.

四分体时期药壁表皮杂交信号仍然很强,但在药室内壁和已逐步退化的中层与绒毡层中

有所减弱(图1(e)).四分体内也有较多的mRNA积累(图1(f)).药隔内除维管组织部位外有所减弱.

游离小孢子时期各部位mRNA表达量明显降低,仅表皮及维管组织部位保持较高的水平,且mRNA的分布集中在细胞周边部位(图1(g)).

成熟花粉时期的表皮和维管组织部位仍保持一定的表达水平,尤其表皮毛上的表达量还很高,而药室内壁、退化的绒毡层、成熟花粉粒以及药隔的其他部位表达量很低,仅在细胞周

(i)).边部位有少量分布(图1(h)、

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图1　烟草花药发育各期钙调素反义RNA探针原位杂交的定位观察

(a)小孢子母细胞时期花药横切面,×405;(b)减数分裂Ⅰ中期,×900;(c)减数分裂Ⅱ后期,×900;(d)减数分裂时

期药壁,×900;(e)四分体时期药壁,×900;(f)小孢子四分体,×900;(g)游离小孢子时期花药横切面,×198;

(h)成熟花粉时期花药横切面,×405;(i)成熟花粉时期药隔维管组织部位,×198;(j)有义RNA探针原位杂交游

离小孢子时期花药横切面(对照),×90.co为药隔;eh为表皮毛;en为药室内壁;ep为表皮;mc为小孢子母细胞;

mi为小孢子;po为花粉;te为小孢子四分体;v为药隔维管组织

3　讨论

　　钙调素在植物组织中分布广泛、功能复杂,很难明确确定其单一生理功能.研究钙调素表

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达水平与植物生长发育过程中生理表现的相关性,是探讨钙调素作用机制的一种重要手段[9].

Means等人[10]发现钙调素在细胞周期的G1～S期之间大量合成,从而推测钙调素在DNA合成调节中起重要作用.我们的实验结果也证实,在花药发育早期,细胞处于分裂旺盛阶段,钙调素mRNA表达水平最高.

细胞分裂、生长过程中,细胞骨架系统中的微管起着重要的作用,如纤维素微纤丝定向、细胞核定位、染色体移动和新细胞板组装等人[11].Fisher等人[12]发现钙调素有稳定微管的作用.我们的实验结果也表明,小孢子母细胞减数分裂的染色体移动过程中以及各种细胞生长发育早期有大量钙调素mRNA积累,而成熟细胞中却表达水平明显降低.

许多研究指出,环境刺激对钙调素表达水平的影响很大[13,14].烟草花药表皮中钙调素mRNA持续表达.究其原因,推测不仅因为表皮细胞在发育早期连续分裂,而且还可能由于器官表面不断接受环境刺激,并通过Ca2+/CaM系统的信号传导而引起生理反应,值得进一步探讨.

Dauwalder等人[15]和Lin等人[16]用组织免疫化学方法检测到钙调素分布于木质部管状分子中,并推测与物质运输有关.我们的实验结果显示,烟草花药药隔维管薄壁细胞中有钙调素mRAN的持续表达.维管薄壁细胞的主要功能是在维管组织中起物质装卸转运作用,钙调素的表达可能与物质的主动转运有关,但与管状分子中的钙调素分布有何相关性,尚未见有关报道.本文首次对钙调素mRNA在植物雄蕊发育过程中的时空表达特征作了初步研究,关于钙调素基因表达在植物有性生殖过程中的作用机制,还有待更加深入的研究.

致谢　感谢日本水稻基因组研究计划Nagmura博士惠赠钙调素cDNA.本工作为国家自然科学基金(批准号:39730260)重点资助项目.

参　考　文　献

1　RobertsDM,LukasTJ,WattersonDM.Structure,function,andmechanismofactionofcalmodulin.CritRevPlantSci,

1986,4:311～319

2　RobertsDM,HarmonAC.Calcium-modulatedproteins:targetsofintracellularcalciumsignalsinhigherplants.AnnuRev

PlantPhysiolPlantMolBiol,1992,43:375～397

3　JenaPK,ReddASA,PoovaiahBW.MolecularcloningandsequencingofacDNAforplantCaM:signal-inducedchangein

theexpressionofCaM.ProcNatlAcadSciUSA,1989,86:3644～3648

4　BretonC,ChaboundA,RochonEM,etal.PCR-generatedcDNAlibraryoftransition-stagemaizeembryos:cloningandex2pressionofcalmodulingenesduringearlyembryogenesis.PlantMolBiol,1995,27:105～113

5　DaviesSP,SinghMB,KnoxRB.Identificationandinsitulocationofpollen-specificgenes.IntRevcytol,1992,140:

19～35

6　SasakiT,SongJ,Koga-banY,etal.Towardcataloguingallricegene:large-scalesequencingofrandomlychosenricecDNAsfromacalluscDNAlibrary.PlantJ,1994,6:615～624

7　SarmbrookJ,FritschEF,ManiatisT.MolecularCloning:aLaboratoryManual,2nded.NewYork:ColdSpringHarbor

LaboratoryPress,1989.16～55

8　陈绍荣,毕学知,吕应堂,等.一种优化的植物组织RNA原位杂交技术.遗传,1998,3:27～30

9　PoovaiahBW,ReddyASN.Calciumandsignaltransductioninplant.CritRevPlantSci,1993,12(3):185～211

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科　学　通　报

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10　MeansAR,TashTS,ChafouleasTG.Physiologicalimplicationsofthepresence,distribution,andregulationofcalmodulin

ineukaryoticcells.PhysiolRev,1982,62(1):1～39

11　GoddardRH,WickSW,SilflowCD,etal.Microtubulecomponentsoftheplantcellcytoskeleton.PlantPhysiol,1994,

104:1～6

12　FisherDD,GilroyS,CyrRJ.Evidenceforopposingeffectsofcalmodulinoncorticalmicrotubules.PlantPhysiol,1996,

112:1079～1087

13　KnightMR,SmithSM,TrewavasAJ.Wind-inducedplantmotionimmediatelyincreasescytosoliccalcium.ProcNatlAcad

SciUSA,1992,89:4967～4972

14　OhSA,KwarkJM,KwunIC,etal.Rapidandtransientinductionofcalmodulin-encodinggene(s)ofBrassicanapusbya

touchstimulus.PlantCellRep,1996,15:586～590

15　DauwalderM,RouxSJ,HardisonL.Distributionofcalmodulininpeaseedlings:immunocytochemicallocalizationin

plumulesandrootapices.Planta,1986,168:461～470

16　LinCT,SunD,SongGX,etal.Calmodulin:localizationinplanttissue.JHistochemCytochem,1986,34:561～567

(1998202210收稿,1998205208收修改稿)

稀土元素对酸雨胁迫小麦抗氧化酶的生物学效应严重玲①②　洪业汤①　杨先科②　付舜珍②　吴善绮②

(①中国科学院环境地球化学国家重点实验室,贵阳550002;②贵州省环境保护科学研究所,贵阳550002)

摘要　利用盆栽实验,研究了稀土元素对酸雨胁迫小麦抗氧化酶的生物学效应.结果表明,酸

雨和稀土元素均能不同程度地影响小麦抗氧化酶活性.酸雨胁迫使小麦抗氧化酶(CAT,SOD)活性随其pH值减小而呈单峰曲线,施用稀土元素后,抗氧化酶活性变化相对稳定,变化曲线峰值向酸度加大的方向后移.在酸雨酸度不大的条件下,稀土元素明显减弱了小麦抗氧化酶对酸雨胁迫的敏感性,增强了小麦抗酸雨的能力.

关键词　酸雨胁迫　稀土元素　小麦　抗氧化酶

活性氧等自由基能引起脂膜过氧化作用,破坏膜及细胞的正常生理过程.生物体内存在着一个防止自由基破坏的膜保护系统———抗氧化系统,SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)就是这个系统中的两种重要保护酶.SOD清除O2而形成H2O2,CAT则是催化H2O2形成H2O,有效地阻止O2和H2O2在体内的积累,排除它们对细胞膜结构潜在伤害的可能性[1].酸雨对作物的一些抗氧化酶的影响[2,3]以及稀土元素能提高作物的抗逆性[4]已有文献报道,但稀土元素对酸雨影响作物抗氧化酶的防护效应尚未见报道.本文首次报道稀土元素对酸雨胁迫下小麦抗氧化酶的生物学效应.

ΗΗ1　材料与方法

　　选择我国酸雨多发区常见并对酸雨敏感的植物———小麦[5](Tritciumaestivum,L)贵花一号为研究材料,种子由遵义龙坪农推站提供;供试稀土由河南商丘稀土微肥厂提供,其元素

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