CLSI临床微生物实验室标准解读

CLSI折点变更的官方说明

Janet Hindler, MCLS MT(ASCP) UCLA Medical Center Los Angeles, California CLSI M100-S20编者 本文由Hindler教授提供，并允许梅里埃公司翻译及印发 Janet Hindler教授现任美国加利福尼亚州洛杉矶医学中心(UCLA)资深专家，华盛顿D.C.公共健康实验室协会顾问等 职。自1994年开始在CLSI细菌抗生素药敏试验委员会的工作，参加制定每年细菌药敏标准，现任CLSI“不常见细菌和苛养菌药敏指南“学组主席，CLSI“累积抗生素药敏试验数据指南(M39-A3)”学组主席等多个CLSI分委会任职。

术语/流程

A. 似乎CLSI和其他一些机构在使用术语“折点”和“判读标准”时候可交替使用。在这两个词之间有区别吗？

无区别，折点和判读标准所指的都是同一个数值。

B. 在哪里我可以找到关于CLSI如何建立药敏折点的标准？

在CLSI M100-S20的第17页有关于药敏折点建立的简要说明。关于药敏折点建立的详细指南参见CLSI 文件M23- 体外敏感性试验标准和质控参数的发展 C-15682 C-1562

C. CLSI修订药敏折点的流程和程序是什么？

简而言之，修订药敏折点包括系统性的回顾来自微生物学，药物学和临床的数据。知名专家，赞助商(来自制药工业)和管理者参与药敏制定流程包括在每年2次的 CLSI 药敏试验小组委员会会议的公开讨论。在制定新上市药物的初始药敏折点时候，需要有对照临床试验数据。尽管在修订药敏折点时最好能够提供对照临床试验数据， 这些数据在应对快速变化的细菌耐药机制和“老药”时多数情况下是不可行的。因此，委员会必须要依赖发表的文献，专家意见和共同商议的流程。在药敏折点修订 时必须要考虑到流行病，临床治疗和监管意见。 CLSI 分委会的会议纪要在下面的链接可以获取。

http://www.clsi.org/Content/NavigationMenu/Committees/Microbiology/AST/AST.htm

1 / 48

在美国FDA和CLSI都建立自己的药敏折点，某些时候这两个机构所设立的药敏折点会有不同。

特别的药敏折点的变化和原由

A. 为什么要对药敏折点进行修订？

药敏折点的修订是因为细菌耐药机制和菌群分布的变化、科学的发展使得对人们对药物引起临床反应的机制有了更深刻的理解以及临床医生对“最佳治疗方案”的运 用。许多临床使用的药物的药敏折点是基于25年前的试验数据得来的。当时的试验方法和试验标准现在来看是不可被接受的。药敏折点需要不断的修订和更新已是 美国和欧洲微生物学家，临床医生和医政管理者所共识。例如，2007年通过的美国食品和药物管理法修正案(FDAAA)规定FDA更新折点，并且美国 FDA已经在2009年作出回应，为行业印发指导文件，以在系统性抗菌药物产品和药敏试验设备中更新药敏试验信息标记。

FDAAA 2007

关于FDAAA 2007

Guidance document 2009

关于Guidance document 2009

B. 2010年的药敏修订都做了哪些更改？

肠杆菌科细菌的部分头孢菌素和氨曲南的折点做了修订，列表如下：

2 / 48

Click to enlarge

C. 为什么要对肠杆菌科细菌的头孢唑啉, 头孢噻肟,头孢唑肟, 头孢曲松, 头孢他啶 和 氨曲南的药物的折点要进行修订？

药敏折点的修订是为了在目前的用药方式和用药剂量的情况下能更好的预示抗菌药物在对抗感染中所起的功效。从产ESBL的细菌中所获取的知识起到了关键的作 用。开始CLSI推荐ESBl的筛查和确证实验并且对于ESBL阳性的细菌，青霉素、头孢菌素和氨曲南的敏感性要从敏感修正为耐药，原由如下：1)观察发 现，某些产ESBL的菌株对上述药物的MIC虽有升高但仍然处于敏感范围(使用之前的折点标准) 2) 有限的临床观察发现产ESBL菌株引起的感染，病人预后较差。ESBL检测的建议是针对于新耐药机制的短期解决方案。接下来，也有发现其他的耐药机制 (如，新型ESBLs酶和类AmpC酶)而且同时产多种酶的耐药菌株的比例逐渐增加使得ESBL的检测变得更加困难。以上事实以及人们对头孢菌素类和单环 β内酰胺类的PKPD因素对治疗效果决定作用的认识导致此次折点的变更。折点修订后， ESBLs筛选和确证试验将不再是决定治疗策略所必需。当细菌同时产多种酶时，ESBL表型的筛查和确证实验的准确性会降低(如，当细菌同时产ESBLs 和AmpC酶时，检测结果会出现假阴性结果)，并且目前所分离的绝大多数菌株都是同时产多种酶的。与耐药机制相比，菌株的MIC和临床治疗结局的相关性更 好。

CLSI认为，新的折点将为病人治疗提供更合理的信息并降低临床实验室工作的不确定度和工作量。

D. 在这次的头孢菌素和氨曲南的折点修订过程中是不是对所有的头孢菌素类药物的折点都重新进行了再评估？

3 / 48

不是的，在美国不使用或不能获得的头孢菌素没有进行再评估，这些药物包括：头孢孟多, 头孢尼西,头孢哌酮和拉氧头孢。因此，当测试这些药物对大肠杆菌、克雷伯菌属和奇异变形杆菌的抗菌活性时，需要进行ESBLs筛选和确证试验。对于 ESBL确证试验阳性的菌株，这些药物的敏感结果均需报告为耐药。耐药机制相比，菌株的MIC和临床治疗结局的相关性更好。

E. 为什么没有对头霉素, 头孢西丁和头孢替坦的折点进行修订？

用目前的药敏折点标准对头孢西丁进行了评估，没有修订头孢西丁的药敏折点。PK-PD药物评估显示，在给定的剂量下药物的浓度是在目标范围之内的。头孢替 坦的药敏折点没有进行修订是因为没有足够的数据来支持。头霉素类不被ESBLs水解并且头霉素的敏感结果不会由于ESBLs的确证试验阳性而改为耐药。

F. 为什么没有对头孢吡肟和头孢呋辛(肠外)的折点进行修订？

没有对头孢吡肟的折点进行修订是基于目前的临床试验数据和PK-PD评估。临床试验证实了对于产ESBL但头孢吡肟敏感(MIC≤8 μg/ml)的菌株感染的病人，头孢吡肟是有疗效的。PK- PD评价结果表明，头孢吡肟日剂量超过3克(即每8小时1克或每12小时2克)可以使头孢吡肟的药物浓度达到评估折点时所使用的目的暴露标准。数据回顾显 示，没有必要修订现行的头孢呋辛(注射)折点，但需注意现行折点只适用于每8小时1.5克或更高的给药剂量。

G. 为什么没有头孢唑啉纸片扩散法的药敏折点？

纸片扩散法抑菌圈的大小和修订后头孢唑啉 MIC的折点之间的关系的研究目前还没有完成。初步的研究并没有确立明确的抑菌圈直径折点，并且头孢唑啉的纸片扩散法试验可能需要使用一种改变含药剂量的新型纸片。

H.为什么头孢噻吩移至肠杆菌科细菌测试/报告的U组？

头孢噻吩的注射用法在美国已不再使用。由于与肠杆菌科相关，口服头孢噻吩主要用于尿路感染的治疗。头孢噻吩的敏感性结果可代表其他几种FDA批准用于治疗尿路感染的口服药物的活性，包括头孢羟氨苄，头孢泊肟，头孢氨苄和氯碳头孢。

I. 对于非肠杆菌科类细菌头孢菌素和氨曲南的折点是否有改变？

没有改变，但是非肠杆菌科细菌头孢菌素和氨曲南的折点目前正处于评估阶段，在将来可能会进行修订。

实验室检测和报告-通则

4 / 48

A. 是否有必要通告临床大夫，药剂师，感染科医生，感染控制专员，和其他P&T委员会头孢菌素和氨 曲南折点已发生修订？

是的，新的折点应与各单位的实验室报告相关人员共同讨论。传染病医生，药剂师和其他了解抗菌药物治疗的医务人员应教导其他医生关于折点修订的情况以及如何用新折点指导药物使用。 重要的是，那些使用药敏结果指导治疗决策的医生须知道，新的折点适用于美国FDA批准的给药方案(如M100-S20表2A所列)。这些反映了来自制药公 司处方信息或产品标签的成人标准治疗剂量。各医疗机构的药物剂量和药物调整政策需重新评估以保证与CLSI推荐折点相一致。临床医生不太可能要求实验室的 常规报告上注明给药方案。

实验室检测和报告-耐药机制的检测

A. 修订后了的头孢菌素和氨曲南的药敏折点是否能检测出特异性的β-内酰胺酶的耐药机制？

不，修订后的折点不是为了确定任何具体的β-内酰胺耐药机制。他们将加强肠杆菌科菌的耐药性检测。修订后的头孢菌素和氨曲南的药敏折点和超广谱β-内酰胺酶

B. 使用新的头孢菌素和氨曲南折点后是否所有产ESBL菌株均被检测为耐药？

不是，修订后的头孢菌素和氨曲南的药敏折点主要关注的是药物MIC和药代动力学，而不是耐药机制。正如前所示，某些ESBL水解某些头孢菌素的能力强于其 他药物，从而导致某些药物(如头孢噻肟)对产酶菌株的MIC明显高于其他药物(如头孢他啶)。而且，细菌在β-内酰胺酶的生成量上也是有差别的，所以产酶 多的菌株其MIC要更高一些。

C. 当使用修订了的药敏折点后，是否仍然需要进行ESBL的筛查和确证实验？

当使用修订后的折点后，可以不用进行ESBL筛查和确证实验。决定是否为感染控制或流行病学目的进行ESBLs确证试验应与传染病医生，药剂师以及感染控制委员会的医务人员进行讨论决定。

D. 如果使用修订后的折点，但是由于感染控制的需要仍然进行ESBL的确证实验。我们如何向临床医生解释产ESBL的肠杆菌科细菌现在对于某些第三亚类的头孢菌素(参见M100-S20术语表I，144页)敏感，而对其他的头孢菌素耐药？

某种耐药机制可以导致不同强度的耐药性，如ESBL对头孢菌素和氨曲南。这些差异可以导致不同的MIC。例如，一些产ESBL菌株用修订后折点对头孢他啶 敏感但对头孢曲松耐药。同样，另一个产ESBLs菌株可能对头孢曲松敏感而对头孢

5 / 48

他啶耐药。目前建议，这些头孢菌素的敏感结果在报告时不改为耐药，因为研 究表明，MIC是产酶菌株感染治疗预后的最佳指标。

E. CLSI的ESBL规则显示青霉素敏感的结果在ESBL确证实验阳性的大肠埃希氏菌，克雷伯菌属，和奇异变

形杆菌中应该修改为耐药。是否有某些产ESBL的菌株的替卡西林和哌拉西林的药敏结果表现为敏感？

自从ESBLs报告规则多年前公布以来，一些研究表明，哌拉西林和替卡西林对产ESBL菌株的MIC将升至耐药区间(≥128ug/ml)。修订后的头孢菌素和氨曲南药敏折点和AmpCβ-类酰胺酶

F. 产AmpC的菌株按照修订的头孢菌素和氨曲南药敏折点是否为耐药？ 不，如同产ESBL的菌株，不是所有的产AmpC的菌株依照修订后的药敏折点都显示为耐药。因为多数肠杆菌科细菌,除了克雷伯菌属和某些大肠埃希菌,会产 生低水平的染色体AmpCβ-内酰胺酶，会导致低水平的MIC，依照修订的后的药敏折点会处于敏感的范围内。然而，最常见的AmpC酶介导的耐药是因为产 高水平AmpC酶突变株的选择(“去阻遏突变体”)从而灭活头孢菌素类继而导致耐药。头孢吡肟是个例外，AmpC酶对于这个药物的水解能力不强。在所有的 病例中，建议结果是什么报告就报告什么。如果菌株高产AmpC酶合并孔通道缺失，也可能对碳青霉烯类、青霉素类和头孢菌素类均耐药。

G. 在用修订后的药敏折点时是否需要做AmpC酶的确定实验？即便是为了感染控制的目的？

目前CLIS没有推荐任何用于检测肠杆菌科细菌产AmpC酶的实验。目前对于这些酶有几种表型检测试验，但是没有一个实验能够为CLIS所推荐以能够有效 的检测出AmpCβ-类酰胺酶。如同ESBL检测试验，AmpC检测方法不被CLSI所推荐用于确定治疗方案。决定是否为感染控制或流行病学目的进行 AmpC检测应与传染病医生，药剂师以及感染控制委员会的医务人员进行讨论决定。因为没有标准化的检测AmpC的方法，需要和使用结果的人员沟通，以使其 了解方法的局限性。

实验室检测和报告

A. 实验室应该如何实施修正后的折点？

每个实验室应制订实施新的折点计划。该计划应包括以下步骤： a) 确认是否药敏试验系统能容纳现在修订后的药敏折点。

如果使用纸片扩散法或参比MIC方法(如实验室自制微量肉汤板或者抗生素平皿)，修订后的药敏折点可以立即使用。对于其他商业化药敏系统，参见以下说明。

b) 和感染控制人员，药剂师和临床医生讨论修订后的药敏折点。

6 / 48

c) 验证修订后的药敏折点(见下)。

注意：“Verify”（而不是validate）是CLIA在用户实验室中建立试验系统性能指标时的官方用词。然而，此处我们更常用的词是“validate”。

B.认证机构和能力验证部门会不会强制我们在新的CLSI表格(CLSI M100-S20)发布后接受修订后的折点？

不，正如M100-S20所说的，“使用FDA批准的药敏检测仪器来检测药物敏感性实验的实验室可以用已有的FDA折点。FDA和CLSI的药敏折点对于临床实验室的认证都是可接受的。

C . 在使用修订后的折点前， 我们能否使用C L S I M100-S19的折点？

是的，在CLS I M100-S20使用前可以仍然使用CLS I M100-S19的折点。如果使用旧的折点标准，实验室还要依照ESBL的测试和报告规则。

D.为什么商业化的药敏鉴定系统不使用新修订的药敏标准？

在美国，商业化药敏测试系统是由美国FDA所管理的。FDA许可要求的一部分是评估药敏仪器测定结果和参考方法测定结果的敏感性类别【敏感，中介，耐药】 的一致性。目前，为了此种比较，药敏试验系统的生产厂家要依照法律使用在“处方信息”或“药物标记”中列出的FDA药敏折点。当CLSI修订了已有的药敏 折点，FDA同样要评估数据以确定此折点的变化在已确定适应征中使用的安全性和有效性。

如果FDA更改了药敏折点，药敏设备厂家要进行额外的研究，提交数据给FDA，并等待评估管理许可。此外，药敏试验系统软件的更改，包括LIS的接口系统 的改变，必须要记录和确认。因此，实施修订后的药敏折点通常需要数月至数年才能完成。目前，FDA没有对头孢菌素和氨曲南的折点进行修改，但是他们正在评 估CLSI所做的修订。因此，商业化药敏试验耗材的生产厂家就不能对其产品做出任何的修改直至FDA承认了新的药敏修订结果。

E. 尽管有以上提到的局限性，实验室有否可能在商业化药敏系统中使用修订后的折点？

是。这是一个必须由每个实验室主任决定的事情。 若满足以下条件则可使用修订后折点：

1) 药敏系统的最低药物测试浓度需能容纳修订的折点浓度; 2) 有一套体系可使用修订的折点来解释MIC结果(例如，能够修改软件系统中的折点或手工解释药敏结果) 3) 需进行实验室内验证。

此策略也在CLSI的M100-S20第18也指出:“通过与传染病医生和药房部门以及治疗和药剂业及感染控制委员会的医务人员进行讨论，临床实验室可推 行修订的折点“。对于纸片扩散法，一旦CLSI在M100文件中公布了其新的折点，临床

7 / 48

实验室即可采用。如果药敏系统包含的抗菌药物浓度足以使用CLSI 折点解释药物敏感性，那么，实验室经过适当的验证后即可使用CLSI折点解释和报告药敏结果。

F. 实验室如何对那些包括低浓度头孢唑啉, 头孢噻肟, 头孢曲松, 头孢克肟, 头孢他啶和(或)氨曲南的FDA认可药敏板进行新折点的验证？ 注：涉及的药敏板包括FDA认可的使用旧折点但浓度涉及涵盖了修订后药敏折点的药敏板。

没有推荐的标准方法用于做这样的验证实验，每个实验室的主任都必须确定哪些对于他/她的实验室是可行的。做这样的确证是为了明确有可接受的“组间一致 性”。这就意味着药敏仪器测定值通过修订后的折点得出的S，I和R的结果和使用CLSI的参比方法纸片扩散法，肉汤稀释法和琼脂稀释法得出的结果有一致 性。通过下表的1和2的方法是最保守的获取S，I和R结果的方法。然而，对于多数的实验室测试，实验室主任最终对于有效性是负有责任的，并且能够决定是否 别的方法是可行的。对于还没有FDA认可的使用新折点的商业药敏系统。

选参考方项 法 纸片扩1 散法 CLSI肉2 汤或琼脂 稀释法 3 其他 对于实验室主任个人来说需要决定使用FDA批准的商业化的MIC实验可以用来做为参比方法，只要其能够提供所需要的药物浓度。 多数情况下，需要将菌株送到参比实验室使用CLSIM07-A8的肉汤或琼脂稀释法来进行实验。 说明 在重新评估目前的药敏折点，修订后的纸片扩散法S，I和R的结果和使用参考方法微量肉汤稀释法和修订后的药敏折点得出的结果相关联，如CLSIM23-A2中所描述的。

如果使用测试系统和纸片扩撒法所得出的结果有相矛盾，则需要使用CLSI的肉

汤稀释法和琼脂稀释法的 结果为最后的结果。 注：尽管CLIA不专门涉及药敏系统的验证。实验室也要明白CLIA对于诊断试验和验证的要求。

CLIA regulations (CLIA 493.1253):

http://wwwn.cdc.gov/clia/regs/toc.aspx

和 http://www.cms.hhs.gov/CLIA/downloads/apcsubk1.pdf

8 / 48

G. 为什么在使用修订后的药敏折点后不需要进行MIC结果的确认？

如果使用一个FDA批准的包含了低浓度药物药敏组合的板条。生产厂家已经证明了从其测试系统所得到的MIC结果和CLSI推荐的琼脂稀释法和肉汤稀释法所获得的结果是有可比性的。

H. 在验证实验中要做多少株菌株以及需要哪些菌株？

没有标准的试验方法可以推荐，实验室主任需要自己决定需要做什么实验。用于验证的样本可能需要有30株细菌，包括：5株ESBL确证实验为阳性的菌株(可 以是肺炎克雷伯菌或大肠埃希菌)；5株ESBL筛查为阳性的但是SBL确证实验是阴性的菌(这些可能是大肠埃希菌)；从枸橼酸杆菌，肠杆菌，大肠埃希菌， 克雷伯菌属，变形杆菌、普罗维登菌，摩根菌，沙雷菌属和其他肠杆菌科细菌中挑选20株(选取的菌株的MIC在使用旧的药敏折点的情况下处于敏感的范围内且 从给定的属中不多于3株菌。)

I. 上述的确证实验的可接受的性能水平是什么？

没有标准化的可以推荐。在多数杂志中发表的有大标本量的可接受的界限都可以使用。若用于FDA批准，生产厂家需要显示出组间一致性大于90%并且极大误差 (假敏感)低于1.5%，重大误差低于3%(假耐药)。Jorgensen建议针对没选择的菌株极大误差≤3%并且重大误差和微小误差合并≤7%。最近 Cumitech认为，对于小样本量，极大误差要为0%，重大误差要小于5%，重大误差和微小误差联合起来要小于10%才是可以接受的误差率。为了计算极 大误差和主要误差，分母分别是耐药菌株数和敏感菌株数。

CLSI23-A3描述了计算可接受误差率的另外一种方法，特别是大多数当验证菌株的MIC在折点附近时。小于10%的极大误差和小于10%的重大误差是可接受的。这些误差的计算所使用的分母包括中介中介范围的MIC±1个稀释度范围内的菌株数，参见CLSI23-A3。

如果是30株菌，且选择标准十分严格，则很难得到性能指标。实验室主任需要在开始确定实验前决定什么是可以接受的性能。 生产商的FDA批准文件。

J. 是否在使用修订后药敏折点时需要做额外特殊的质控实验？

不用，当使用修订后的药敏折点时不用对质控实验的流程做任何更改。

参考文献: 略

中国医学科学院北京协和医学院 赵春江 杨启文 王辉 翻译

9 / 48

药敏纸片法在药敏检测中的局限--革兰阴性菌(CLSI M100-S20)

药敏纸片法在药敏检测中的局限--革兰阳性菌(CLSI M100-S20)

10 / 48

11 / 48

12 / 48

13 / 48

CLSI临床微生物实验室标准解读

CLSI 临床微生物实验室标准解读 开篇词

开篇词

陈民钧教授 北京协和医院 2009年6月18日

临床微生物的常规工作包括微生物鉴定、可疑致病菌的药敏试验、耐药监测、流行病学调查等，本栏目将就这些内容的标准化展开讨论。

就药敏试验，这里有两个问题：一是两大类药敏试验方法－MIC法和纸片扩散法要科学化及标准化，使室内及室

间结果有可比性；一是要用现代折点来明确药敏数据、药代学及药效学、感染的疗效结局三者内在关系，及它的的临床指导意义。世界许多发达国家都建立了机构来 解决这两个问题。最著名的有美国临床和实验室标准化研究所（CLSI，前称NCCLS）的药敏试验分会及欧洲共同体药敏试验委员会（EUCAST）。我国 卫生部1997年规定，在未建立我国的药敏试验委员会，并获得科学的数据前，暂时过渡地执行CLSI 的药敏试验有关的一系列指南。在此文件之后，经多方的努力及宣传培训，细菌室的常规药敏试验逐渐归入CLSI 指南的轨道，取得了不小的进步，但离临床微生物全面标准化的目标仍差距甚远。

王辉教授被邀请主持此临床微生物标准化栏目，选择为几年来世界药敏试验标准化及建立现代折点方面的重大变革撰文。今后她还会就临床微生物各项任务的标准化 撰文讨论。王辉教授现任职于中国医学科学院北京协和医院检验科细菌室，并于2009年4月被聘为CLSI药敏试验分会顾问委员会顾问。CLSI 近年来正积极面向国际化发展，他们邀请王辉进入CLSI，表明重视中国临床微生物的工作进步与发展，热望中国临床微生物工作更快更完善地纳入世界标准化范 围。

我很高兴梅里埃中国公司设置此栏目来促进中国临床微生物标准化工作的发展。

CLSI临床微生物实验室标准解读

葡萄球菌

CLSI 临床微生物实验室标准解读 第一辑

14 / 48

2009年CLSI (M100-S19)中葡萄球菌属药敏更新部分

中国医学科学院北京协和医院 王辉 陈宏斌

2009年CLSI在版式上的显著变化是将K-B法和MIC法放在同一个表格中，方便比较。对于葡萄球菌属，主要有以下更新和变化：一是去除凝固酶 阴性葡萄球菌苯唑西林纸片扩散法试验；二是删除了万古霉素纸片扩散法的药敏折点；三是增加了金葡菌莫匹罗星高水平耐药性的检测。 一、β-内酰胺类的变化

2009年CLSI指出在报告青霉素对葡萄球菌敏感之前，即当MIC≤0.12μg/ml或抑菌圈直径≥29 mm，需要做可诱导的β-内酰胺酶试验。其操作如下：将分离菌株传种至血平皿或MH琼脂上，贴上作为诱导子的苯唑西林或头孢西丁纸片，35℃孵育 16-18h，挑取抑菌圈边缘的细菌做b-内酰胺酶试验。b-内酰胺酶试验阳性可以预测青霉素、氨苄西林、阿莫西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林和哌 拉西林耐药。 在检测MRS时，金葡菌、路登葡萄球菌和其它凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)对苯唑西林的折点和选取的药敏方法有所不同，具体见表1(见下页)。在 CoNS(除外路登葡萄球菌以外)中，由于苯唑西林纸片扩散法存在太多假“R”，所以此法被去除，而是采用头孢西丁纸片法、苯唑西林/头孢西丁MIC法检 测mecA介导的苯唑西林耐药。

对于由CoNS(除外表皮葡萄球菌)引起的严重感染，当苯唑西林MIC值在0.5-2μg/mL之间时，应当检测该菌株是否产mecA基因或 PBP2a(图1)。利用头孢西丁检测mecA 介导的苯唑西林耐药所推荐的质控菌株是金葡菌

ATCC25923-mecA阴性(抑菌圈直径23-29mm)和金葡菌ATCC43300-mecA阳性 (抑菌圈直径≤21mm)。

15 / 48

图1 CoNS*苯唑西林MIC结果报告策略

表1. MRSA的检测方法及判定折点 菌名 金葡菌 路登葡萄球菌 金葡菌、路登葡萄 球菌 CoNS(除外路登葡 萄球菌) CoNS(除外路登葡 萄球菌) 药物浓度 抑菌圈直径折点(mm) MIC解释标准(mg/mL) 备注 头孢西丁可以用作苯 唑西林耐药检测的替 代药。根据头孢西丁 的结果报告苯唑西林 敏感或耐药 1mg苯唑西林纸 1mg苯唑西林 30mg头孢西丁 S - I - R - S ≤2 I R - ≥4 - ≥4 ≥13 11-12 ≤10 ≤2 ≥22 - - - - - ≤4 (头孢西丁) ≤0.25 ≥8 - (头孢西丁) 1mg苯唑西林 - ≥0.5 - - 30mg头孢西丁 ≥25 - ≤24 -

16 / 48

二、糖肽类耐药性的检测

2009年CLSI推荐采用MIC法检测所有葡萄球菌对万古霉素的敏感性，去除了纸片扩散法。这是因为纸片扩散法不能区分万古霉素敏感、中介耐药的 葡萄球菌。图2显示采用Etest测定万古霉素对金葡菌的MIC为8mg/ml，为“I”，而采用纸片扩散法，抑菌圈直径为17mm，为“S”。万古霉素 纸片扩散法仅仅对于检测含vanA的金葡菌(VRSA)是可靠的。如果抑菌圈直径≥7mm，需要检测万古霉素的MIC值。对万古霉素MIC值升高的金葡菌 (MIC ≥4mg/mL)和

CoNS(MIC≥8mg/mL)需要送往参考实验室进一步确证。目前的研究没有重新评估替考拉宁纸片扩散法的折点，因此纸片扩散法能 否将替考拉宁中介、耐药的葡萄球菌与敏感的菌株区分开来还不清楚。

2009CLSI明确指出采用含6mg/ml万古霉素脑心浸液(BHI)琼脂筛选万古霉素MIC≥8mg/ml的金葡菌，具体步骤如下：制备含6mg /ml万古霉素脑心浸液(BHI)琼脂，将待测菌株调整到0.5麦氏单位菌悬液，用加样枪吸取10ml菌悬液点种到制备好的琼脂板上，或者是用菌悬液浸湿 棉签并拧干多余的液体，在制备好的琼脂板上点种直径10-15mm的面积，35±2℃空气孵育24小时，>1个菌落或薄膜生长即可推测为万古霉素敏 感性下降金葡菌。进一步的试验是用确证的MIC方法检测在筛选平皿上生长金葡菌对万古霉素的MIC值。BHI琼脂筛选法不能稳定地检测所有万古霉素中介金 葡菌，一些万古霉素MIC为4mg/ml的金葡菌不能在琼脂板上生长。推荐的质控菌株是粪肠球菌ATCC29212(敏感)和粪肠球菌 ATCC51299(耐药)。

异质性万古霉素中介金葡菌(hVISA)是指子代中含万古霉素MIC值8-16mg/ml的细胞，大多数发生于万古霉素治疗的病人，hVISA可能造成万 古霉素治疗失败。采用标准的万古霉素MIC试验，一些hVISA的MIC值在1-2mg/ml之间，CLSI中还没有检测hVISA的特异方法。

17 / 48

图2 采用CLSI M100-S18万古霉素纸片扩散法折点，将“I”金葡菌错误地判断为“S”(此图片来

自Janet Hindler教授的幻灯片)

三、达托霉素药敏试验

CLSI规定采用肉汤稀释法检测达托霉素MIC值，使用的培养基是CAMHB，需要将

Ca2+调整至50mg/mL。葡萄球菌属对达托霉素的MIC 折点只定义敏感范围(≤1mg/mL)，目前没有中介和耐药的折点。菌株MIC值高于敏感折点被定义为不敏感(nonsusceptible)。实验室如 果碰到达托霉素不敏感株，需要重新鉴定菌株和检测药敏，然后送往参考实验室进一步确认。

2009年CLSI指出纸片扩散法检测达托霉素不可靠，琼脂稀释法用于达托霉素还没有被批准。

四．金葡菌莫匹罗星高水平耐药性的筛选

莫匹罗星属于pseudomonic acid类抗生素，主要用于皮肤感染(如脓疱病)治疗和金葡菌鼻腔定植的清除，不需要常规检测药敏，仅仅在特别必要时检测。2009年CLSI提出要筛选 金葡菌对莫匹罗星的高水平耐药(见表2)。研究表明莫匹罗星对金葡菌MIC≥512mg/mL，与定植不能清除相关。虽然此文件没有定义莫匹罗星敏感性的 具体折点，但纸片扩散法和MIC筛选法可以鉴定莫匹罗星MIC值≥512mg/mL菌株。

表2 金葡菌莫匹罗星高水平耐药筛选试验 纸片扩散法筛选 MIC筛选 200mg莫匹罗星纸片 MHA，35℃空气孵育24h 无抑菌圈：高水平耐药 有抑菌圈：非高水平耐药 单孔-256mg/ml 微量肉汤稀释法，35℃空气孵育24h 生长：高水平耐药 不生长：非高水平耐药 金葡菌ATCC25923 (200mg纸片)–mupA阴性(抑菌圈直径29-38mm) 金葡菌ATCC BAA1708–mupA阳性(无抑菌圈) 金葡菌ATCC29213–mupA阴性(MIC0.06-0.5mg/mL) 粪肠球菌ATCC29212–mupA阴性(MIC16-128mg/mL) 18 / 48

金葡菌ATCCBAA1708–mupA阳性(不生长)

纸片扩散法在药敏检测中的局限--革兰阴性和阳性菌(CLSI M100-S19)

19 / 48

20 / 48

21 / 48

CLSI临床微生物实验室标准解读

链球菌

CLSI 临床微生物实验室标准解读 第二辑

CLSI的链球菌属药敏解读 北京协和医院 杨启文 王辉

对于链球菌属，CLSI将药敏分为3个部分：肺炎链球菌的药敏解读、b溶血链球菌的药敏解读和草绿色链球菌的药敏解读。不用的菌种CLSI有不同的规定，现

22 / 48

对链球菌属的CLSI药敏作逐一解读： 1. 肺炎链球菌：

(1) 肺炎链球菌对青霉素和其他b内酰胺类药物的敏感性检测

CLSI对该组合的解释标准按照感染类型和给药途径不同分为三类(表1)，3种情况均有不同的折点。

对于非脑膜炎的青霉素静脉给药治疗，CLSI认为对于青霉素MIC≤2µg/ml的菌株，肾功正常的成年人，应每次至少应用200万单位，每四小时 给药一次（每天1200万单位）的方式进行治疗。对于MIC为4µg/ml的菌株则须将剂量提高至每天1800-2400万单位。对于非脑脊液标本中分离 出的肺炎链球菌，需同时使用脑膜炎和非脑膜炎的折点来报告青霉素的敏感性。

对于脑膜炎的青霉素静脉给药治疗，CLSI 认为需将青霉素用量提高至最大(如肾功正常的成年人可使用每次300万单位，每四小时一次的给药方式)。对于脑脊液中分离的肺炎链球菌，仅需采用脑膜炎的折点报告青霉素的敏感性。

常规工作中可以用含5%脱纤维羊血的Mueller-Hinton平皿进行苯唑西林的纸片扩散法来检测青霉素的敏感性。苯唑

西林的抑菌圈直径≥20mm时，可以判定青霉素为敏感(相当于青霉素的MIC≤0.06mg/ml)。但纸片扩散法不能用于区分耐药菌株和低耐菌株，因此 抑菌圈直径≤19mm的菌株可能是青霉素耐药或中介甚至是敏感的菌株，对于这些菌株应该进行肉汤或琼脂稀释试验测定青霉素的MIC。需要注意的是，苯唑西 林纸片扩散法是用来预测青霉素敏感性的，苯唑西林MIC本身无价值，因此无需测定苯唑西林的MIC。

对于非脑膜炎的菌株，青霉素的MIC可以预测下列β内酰胺类药物的敏感性：青霉素MIC≤0.06mg/ml(或苯唑西林

抑菌圈直径≥20mm)提示菌株对氨苄西林(口服或肠外)、氨苄西林-舒巴坦、头孢克罗、头孢地尼、头孢妥仑、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢唑肟、头孢呋辛、 亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南也敏感；青霉素MIC≤2µg/ml提示菌株对阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松和厄他培南也敏 感。

23 / 48

表1. 青霉素对肺炎链球菌的敏感性判定折点(µg/ml)

必须注意，虽然阿莫西林、氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛、厄他培南、亚胺培南和美罗培南可用于治疗肺炎链球菌感染，但对这些药物尚无可靠的纸片法药敏试验，最好用MIC法测定其体外抗菌活性。

对于脑脊液中分离出的肺炎链球菌，需尽快用可靠方法检测和报告青霉素和头孢噻肟(或头孢曲松或美罗培南)的MIC值。这些菌株也需要用MIC法或纸片扩散法报告万古霉素的药敏结果。

表2. 从脑脊液中分离到的肺炎链球菌需常规报告药物的折点

（2）肺炎链球菌对非β内酰胺类药物的敏感性

CLSI对大环内酯类药物的红霉素、阿奇霉素、克拉霉素和地红霉素给出了纸片扩散法和MIC法的折点，并指出红霉素的敏感耐药性可以预测阿奇霉素、克拉霉素和地红霉素的敏感耐药性。对于尿路分离的菌株，常规不报告大环内酯类药物的敏感性。

对于临床常用的氟喹诺酮类药物，CLSI提供了纸片扩散法和MIC法的折点。并提示：对左氧氟沙星敏感的肺炎链球菌可预测对吉米沙星和莫西沙星也敏感。然而，对吉米沙星或莫西沙星敏感的肺炎链球菌不能认为对左氧氟沙星也敏感。 2. β溶血链球菌

CLSI在此部分的描述中，β溶血链球菌包括携带A群(化脓链球菌)、B群(无乳链球菌)、C群或G群抗原的大菌落化脓性菌株。而携带A、C、F或G抗原的小菌落β溶血菌株(咽峡炎链球菌，以前称之为米勒链球菌)则归属于草绿色链球菌群，药敏折点也应参照草绿色链球菌群。

对于化脓链球菌(A群)或无乳链球菌(B群)，青霉素和其他β内酰胺类药物的药

24 / 48

敏试验不需常规进行。这时由于目前还没有耐药菌株的报道。CLSI表格中所列出的折点仅是为了药物研发、流行病学以及监测耐药性的目的。任何测定为非敏感的菌株均需送至参考实验室进行确证。

假如菌株对青霉素敏感，则可以预测对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林－克拉维酸、氨苄西林－舒巴坦、头孢克罗、头孢唑啉、头孢地尼、头孢吡肟、头孢丙烯、头 孢噻肟、头孢布烯(仅对A群链球菌)、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、头孢拉定、头孢噻吩、头孢匹林、厄他培南、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南 也敏感，不必再进行这些药物的敏感性试验。对于厄他培南、美罗培南和达托霉素，CLSI不推荐使用纸片扩散法实验，也没有提供纸片法的判定折点。

怀孕期妇女B群链球菌的预防用药推荐为青霉素或氨苄西林。对于过敏反应低危的妇女，若对青霉素过敏可改用头孢唑啉；对于过敏反应高危的妇女，若对青霉素过 敏则改用克林霉素或红霉素。B群链球菌对氨苄西林、青霉素和头孢唑啉敏感，但可能对克林霉素和/或红霉素耐药。当对青霉素过敏反应高危的怀孕期妇女分离出 B群链球菌时，需对克林霉素和红霉素进行药敏试验并报告。

大环内酯类耐药的β溶血链球菌可以体现出对克林霉素的结构型或诱导型耐药[由erm基因介导的23S rRNA甲基化，也称为MLSB(大环内酯-林可霉素-链阳霉素B)耐药]，或仅对大环内酯类耐药(由mef基因介导的外排泵机制)。诱导型克林霉素耐药 可以用D试验检测：按照标准的纸片扩散法程序，在15mg红霉素纸片周围贴2mg克林霉素纸片，两纸片的边缘相距12mm，孵育后，若克林霉素纸片抑菌圈 靠近红霉素一侧未出现切割现象，则报告菌株对克林霉素敏感。

若克林霉素纸片抑菌圈靠近红霉素一侧出现切割现象(D形抑菌圈)，则表克林霉素可被诱导耐药。这样的菌株应报告为“克林霉素耐药”，另外，报告中还应附上以下内容：

“该菌株可诱导出对克林霉素的耐药性。但在某些病人中，使用克林霉素可能仍然有效。” 3. 草绿色链球菌群

假如菌株对青霉素敏感，则可以预测对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林－克拉维酸、氨苄西林－舒巴坦、头孢克

罗、头孢唑啉、头孢地尼、头孢吡肟、头孢丙烯、头孢噻肟、头孢布烯(仅对A群链球菌)、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、头孢拉定、头孢噻吩、头 孢匹林、厄他培南、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南也敏感，不必再进行这些药物的敏感性试验。对于青霉素、氨苄西林、厄他培南、美罗培南和达托霉 素，CLSI不推荐使用纸片扩散法实验，也没有提供纸片法折点。

从常规无菌部位(如脑脊液、血液、骨髓)分离出的草绿色链球菌需尽快用MIC法检测青霉素的敏感性。对青霉素或氨苄西林中介的菌株需与氨基糖苷类药物进

25 / 48

行联合治疗以达到杀菌效果。 4. CLSI对链球菌属的药敏通用规则：

CLSI对链球菌属的药敏有一些通用规则，综述如下： (1) 下列抗菌药物不能常规用于报告脑脊液感染菌株，这些药物治疗脑脊液感染无效，包括

a. 仅可口服的药物

b. 第一代和第二代头孢菌素(除了静脉用头孢呋辛以外) c. 克林霉素 d. 大环内酯类 e 四环素类 f. 氟喹诺酮类

(2) 若用纸片扩散法进行链球菌的药敏试验，则需测量肉眼判断能完全抑制菌落生长的抑菌圈直径。抑菌区域以肉眼观察无明显可见的菌落。测量时将平皿盖子打开，通过反射光从琼脂的上表面测量抑菌圈。忽略抑菌圈边缘的针尖样、只可通过放大镜观察到的菌落。

(3) 对于一些菌种/抗菌药物组合，发生“非敏感”的几率极低。这些菌种若产生非敏感的结果，则需再次确认菌株的鉴定和药敏试验。这些菌株需保存并送至参考实验室确证。

(4) 链球菌的不常见表型：

未报道的表型，不常见的表型和/ 或技术错误导致的结果 氟喹诺酮类－耐药 利奈唑胺－非敏感* 万古霉素－非敏感* 氨苄西林或青霉素－非敏感* 第三代头孢菌素－非敏感* 达托霉素－非敏感* 利奈唑胺－非敏感* 万古霉素－非敏感* 菌种或菌群 在特殊地区不常见 的表型和/或技术 错误导致的结果 青霉素－耐药 第三代头孢菌素－ 耐药 肺炎 链球菌 链球菌， beta群 青霉素－中介或 耐药 链球菌， viridans群 26 / 48

达托霉素－非敏感* 利奈唑胺－非敏感 万古霉素－非敏感* 笔者注释：CLSI药敏试验和折点需要不断更新和完善，各位临床微生物室的同仁们，如果在常规药敏试验中，发现CLSI指南有任何问题或疑问，请发Email至wh_bj@tom.com(王辉)，笔者很愿意将这些问题提交至CLSI年度工作会议中进行讨论；同时CLSI 也希望听到中国用户的反馈和意见。

CLSI临床微生物实验室标准解读

CLSI2010更新

27 / 48

CLSI 临床微生物实验室标准解读 第三辑

2010年CLSI药敏试验的更新

中国医学科学院北京协和医学院 杨启文 王辉

美国临床与实验室标准化研究所(The Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)是一个国际性、跨学科、非营利的、致力于发展操作标准的教育组织。其抗菌药物敏感性试验小组委员会(Subcommittee on Antimicrobial Susceptibility testing)每年组织该领域专家和药厂代表等对药敏相关文件M100进行一次修订。目前我国的临床微生物实验室均以CLSI文件作为药敏指导文件进行 试验操作和报告，本文将CLSI M100-S20(2010年)的主要更新点总结如下：

一、主要格式的更新：

下表显示了一些在M100-S19(2009年)中位于最后的附录在M100-S20(2010年)文件中新的命名、编号和位置。 表1. M100-S20的格式更新

M100-S19中的名称 附录A(ESBLs的筛选和确证试验) 附录G(碳氰酶烯酶的筛选和确证试验) 附录B(金黄色葡萄球菌的筛选试验) M100-S20名称/位置 补充性表格2A-S1/表2A的最后 补充性表格2A-S2/表2A的最后 补充性表格2C-S3/表2C的最后 附录C(凝固酶阴性葡萄球菌的筛选试验) 补充性表格2C-S4/表2C的最后 附录D(肠球菌的筛选试验) 附录E(药敏结果的确证建议) 附录F(药敏试验的质控菌株) 补充性表格2D-S5/表2D的最后 附录A/ M100-S20的最后，术语表前 附录B/ M100-S20的最后，术语表前 二、表1和表2介绍内容中的更新

(1) 修订了“非敏感”的定义：M100-S20中对“非敏感”的定义是由于耐药菌株缺失或稀少因而仅确立了敏感性解释标准。当药物对菌株的MIC高于或抑菌圈 直径低于此折点时需报告为非敏感。非敏感并不意味着菌株携带某种耐药机制。有可能MIC高于敏感折点的菌株缺乏耐药机制并且属于野生菌株，只不过其出现于 敏感性折点确立后。对于“非敏感”的菌株，菌株鉴定和药敏结果需被再次确认。

(2) 对“使用头孢噻吩的折点仅用于预测对其他头孢菌素的敏感性”增加注释：在M100-S20中，头孢噻吩的折点仅可用于预测菌株对口服药物，包括孢羟氨苄， 头孢泊肟，头孢氨苄和氯碳头孢的敏感性。旧的数据认为头孢噻吩的结果可以预测某些其他头孢菌素的敏感性可能仍然正确，但目前的数据尚不能支持此论点。

28 / 48

(3) 在M100-S20的第26页增加第VII部分来描述筛选试验并总结他们的局限性以及对应的确证试验。该部分总结了

肠杆菌科菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌和肺炎链球菌的耐药表型初筛试验和对应的确证试 验。

(4) 在表1和1A的警告框内，M100-S20将头霉素类药物加入脑脊液分离菌株中不能常规报告的抗菌药物列表中。

在M100-S19中，口服抗菌药物、第一代和第二代头孢菌素(除外静脉用头孢呋辛)、克林霉素、大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类被列为脑脊液分离菌株 中不能常规报告的抗菌药物，因为这些药物不是脑脊髓感染的选择药物，在

M100-S20中，头霉素类药物(如头孢西丁、头孢美唑和头孢替坦)也被纳入此类 药物。

三、肠杆菌科菌相关的更新

(1) 修订了头孢唑啉、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松和氨曲南的折点，并在折点后增加了对应 的用药方案。 Ⅰ 修订折点的原因

在CLSI文件M100-S20的第17页有一个关于折点如何建立的简短注释。本段话参考的是CLSI关于折点发展的指南

性文件：M23－《体外药敏试验标准和质量控制参数的发展》。简单地说，修改折点涉及微生物学、药理学和临床数据的系统性回顾。公认的专家，制药业赞助商 和监管机构参与这一过程，其中包括CLSI药敏试验小组委员会每年两次的在公开会议讨论。若为新的药物建立原始折点，对照的临床试验数据是必需的。然而在 修改折点时，虽然对照临床试验是可取的，但在处理快速变化的细菌耐药机制和“老”的药物时这些试验往往并不可行。因此，小组委员会必须依赖于由发表的文献 资料、专家意见和共识所支持的最佳实践。流行病学、临床实践以及任何折点修订的监管影响必须予以考虑。

折点需要修订是由于不断变化的耐药机制和细菌菌群分布，不断进步的科学增进了人们对临床反应药理学因素

的认识以及 “最佳治疗”被临床医生所接受。在临床实践中常规使用的许多药物折点源于25年前的临床操作，而这些操作以今天的监管和质量保证标准来看是不可接受的。不 论在美国和欧洲，不断评估和更新折点已得到了微生物学家、临床医生和监管机构的普遍认同。例如，2007年通过的美国食品和药物管理法修正案 (FDAAA)规定FDA更新折点，并且美国FDA已经在2009年作出回应，为行业印发指导文件，以在系统性抗菌药物产品和药敏试验设备中更新药敏试验 信息标记。M100-S20修订后的折点能更好地反映抗菌药物在以目前推荐方案治疗由菌株引起的感染时的真实疗效。对产ESBL菌株的研究结果发挥了重大 作用。最初CLSI推荐进行ESBLs筛选及确证测试，并规定对于产ESBL的菌株，将青霉素，头孢菌素和氨曲南的药敏结果由敏感改为耐药，这条规定基于 以下几点：1) 研究观察到某些产ESBL菌株，以上药物的MIC有升高但仍然在敏感区间

29 / 48

(使用旧的折点)；2) 有限的临床观察发现，对于产ESBL菌株引起的感染，病人预后较差。ESBL试验建议是处理一个新型耐药机制的短期解决方案。随后，更多的耐药机制被发现 (例如，新型的ESBLs和AmpC酶)，并且越来越多的菌株被发现产多种酶导致ESBL的检测更加复杂。以上事实以及人们对头孢菌素类和单环β内酰胺类 的PK-PD因素对治疗效果决定作用的认识导致折点的变更。折点修订后，ESBLs筛选和确证试验将不再是决定治疗策略所必需。当菌株产多种酶时(如当菌 株同时产ESBLs和AmpC酶时将导致假阴性的结果)ESBL表型检测和确证试验的准确性将降低，而在当前，产多种酶的菌株已非常普遍。菌株的MIC与 临床预后的相关性强于菌株携带的耐药机制。CLSI认为，新的折点将为病人治疗提供更合理的信息并降低临床实验室工作的不确定度和工作量。 Ⅱ 新折点与旧折点的比较

对于肠杆菌科菌，头孢菌素和氨曲南的折点修订如下(作为比较，也列出旧的折点)：

表2. M100-S20 MIC折点更新 (μg/ml):

抗菌药物 头孢唑啉 头孢噻肟 头孢唑肟 头孢曲松 头孢他啶 氨曲南 旧 (M100-S19) 敏感 ≤8 ≤8 ≤8 ≤8 ≤8 ≤8 中介 16 16-32 16-32 16-32 16 16 耐药 ≥32 ≥64 ≥64 ≥64 ≥32 ≥32 新 (M100-S20) 敏感 ≤1 ≤1 ≤1 ≤1 ≤4 ≤4 中介 2 2 2 2 8 8 耐药 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥16 ≥16 表3. M100-S20纸片扩散法折点更新(mm):

抗菌药物 头孢唑啉 头孢噻肟 头孢唑肟 头孢曲松 头孢他啶 氨曲南 ≥18 ≥23 ≥20 ≥21 ≥18 ≥22 旧 (M100-S19) 敏感 中介 15-17 15-22 15-19 14-20 15-17 16-21 耐药 ≤14 ≤14 ≤14 ≤13 ≤14 ≤15 新 (M100-S20) 敏感 NA ≥16 ≥25 ≥23 ≥21 ≥21 中介 NA 23-25 22-24 20-22 18-20 18-20 耐药 NA ≤22 ≤21 ≤19 ≤17 ≤17 NA=未确定

与头孢唑啉修订后MIC折点相关的抑菌圈直径折点尚未确立。初步的研究并没有

30 / 48

确立明确的抑菌圈直径折点，

并且头孢唑啉的纸片扩散法试验可能需要使用一种改变含药剂量的新型纸片。 另外，以下药物对肠杆菌科菌的折点也被重新评估但没有被修改(这些药物的纸片扩散法折点也没有被修改)： 表4. M100-S20 MIC折点(μg/ml)

抗菌药物 头孢呋辛(肠外) 头孢吡肟 头孢替坦 头孢西丁 旧 (M100-S19) 新 (M100-S20) 敏感 中介 耐药 敏感 中介 耐药 ≤8 ≤8 16 16 ≥32 ≤8 ≥32 ≤8 16 16 ≥32 ≥32 ≤16 32 ≤8 16 ≥64 ≤16 32 ≥64 ≥32 ≤8 16 ≥32 头孢西丁折点不修改是因为当前数据支持现有的折点。 PK-PD评估表明，推荐的药物剂量在目标范围内。头

孢替坦的折点未改变是因为没有足够的数据支持。头霉素类不被ESBLs水解并且头霉素的敏感结果不会由于ESBLs的确证试验阳性而改为耐药。 头孢吡肟折点没有修改是基于临床试验数据和PK - PD评估。临床试验证实了对于产ESBL但头孢吡肟敏感(MIC≤

8μg/ml)的菌株感染的病人，头孢吡肟是有疗效的。PK- PD评价结果表明，头孢吡肟日剂量超过3克(即每8小时1克或每12小时2克)可以使头孢吡肟的药物浓度达到评估折点时所使用的目的暴露标准。

数据回顾显示，没有必要修订现行的头孢呋辛(注射)折点，但需注意现行折点只适用于每8小时1.5克或更高的给药剂量。

对于一般不在美国使用或销售的头孢菌素，如头孢孟多，头孢尼西，头孢哌酮和拉氧头孢，其折点没有重新评

估。因此，当测试这些药物对大肠杆菌、克雷伯菌属和奇异变形杆菌的抗菌活性时，需要进行ESBLs筛选和确证试验。对于ESBL确证试验阳性的菌株，这些药物的敏感结果均需报告为耐药。

注射用头孢噻吩不再在美国使用。由于与肠杆菌科相关，口服头孢噻吩主要用于尿路感染的治疗。头孢噻吩的

敏感性结果可代表其他几种FDA批准用于治疗尿路感染的口服药物的活性，包括头孢羟氨苄，头孢泊肟，头孢氨苄和氯碳头孢。故M100-S20将头孢噻吩由检测/报告A组转至U组。

Ⅲ 使用新折点的报告原则：

当使用经修订的折点则没有必要进行ESBL初筛和确证试验来报告结果以指导病人治疗。决定是否为感染控制或

流行病学目的进行ESBLs确证试验应与传染病医生，药剂师以及感染控制委员会的医务人员进行讨论决定。新的折点应与各单位的实验室报告相关人员共同讨

31 / 48

论。传染病医生，药剂师和其他了解抗菌药物治疗的医务人员应教导其他医生关于折点修订的情况以及如何用新折点指导药物使用。重要的是，那些使用药敏结果指 导治疗决策的 医生须知道，新的折点适用于美国FDA批准的给药方案(如M100-S20表2A所列)。这些反映了来自制药公司处方信息或产品标签的成人标准治疗剂量。 各医疗机构的药物剂量和药物调整政策需重新评估以保证与CLSI推荐折点相一致，因为临床医生不太可能要求实验室的常规报告上注明给药方案。

Ⅳ 修订后折点与ESBL的关系

不是所有的产ESBLs菌株使用新修订的折点均检测为耐药。修订后的头孢菌素和氨曲南折点都关注于MIC和药

代动力学而不是耐药机制。正如前所示，某些ESBL水解某些头孢菌素的能力强于其他药物，从而导致某些药物(如头孢噻肟)对产酶菌株的MIC明显高于其他药物(如头孢他啶)。另外，不同菌株的产酶量是有差异的，因此当产酶量多时MIC会升高。

当使用经修订的折点则没有必要进行ESBL初筛和确证试验来报告结果以指导病人治疗。某种耐药机制可以导

致不同强度的耐药性，如ESBL对头孢菌素和氨曲南。这些差异可以导致不同的MIC。例如，一些产ESBL菌株用修订后折点对头孢他啶敏感但对头孢曲松耐 药。同样，另一个产ESBLs菌株可能对头孢曲松敏感而对头孢他啶耐药。目前建议，这些头孢菌素的敏感结果在报告时不改为耐药，因为研究表明，MIC是产 酶菌株感染治疗预后的最佳指标。

Ⅴ 修订后折点与AmpC的关系

与产ESBLs菌株一样，并非所有产AmpC酶菌株用修订后折点将测试为耐药。这是因为除了克雷伯菌属和一些大肠杆菌外，大多数肠杆菌科细菌均低水平产染色体AmpCβ-内酰胺酶，头孢菌素的MIC较低并处于敏感范围(使

用新折点)。然而，最常见的AmpC酶介导的耐药是因为产高水平AmpC酶突变株的选择(“去阻遏突变体”)从而灭活头孢菌素类继而导致耐药。一个例外是 头孢吡肟，其不容易被AmpC酶灭活。在所有情况下，建议将检测结果和报告结果一致。如果菌株高产AmpC酶合并孔通道缺失，也可能对碳青霉烯类、青霉素 类和头孢菌素类均耐药。目前CLSI不推荐任何检测肠杆菌科菌中AmpC酶的试验。一些AmpC酶的表型检测试验已公布但目前这些实验还未充分评估，因此 尚未被CLSI推荐。正如ESBLs检测试验，CLSI不推荐AmpC酶检测试验以进行治疗决策。 决定是否为感染控制或流行病学目的进行AmpC检测应与传染病医生，药剂师以及感染控制委员会的医务人员进行讨论决定。由于没有检测产AmpC酶表型的标准化方法，这些方法的局限性，必须传达给那些使用这些结果的 人员。

Ⅵ 修订后折点在商品化药敏系统中的应用

若满足以下条件则可在商品化药敏系统中使用修订后折点：1) 药敏系统的最低

32 / 48

药物测试浓度需能容纳修订的 折点浓度; 2) 有一套体系可使用修订的折点来解释MIC结果(例如，能够修改软件系统中的折点或手工解释药敏结果)和 3) 需进行实验室内验证。此策略也在CLSI的M100-S20第18页指出：“通过与传染病医生和药房部门以及治疗和药剂业及感染控制委员会的医务人员进行 讨论，临床实验室可推行修订的折点”。对于纸片扩散法，一旦CLSI在M100文件中公布了其新的折点，临床实验室即可采用。如果药敏系统包含的抗菌药物 浓度足以使用CLSI折点解释药物敏感性，那么，实验室经过适当的验证后即可使用CLSI折点解释和报告药敏结果。

表5. M100-S20中新增的药敏质控范围

四、葡萄球菌属相关的更新

(1) 澄清对苯唑西林耐药金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌的结果报告原则：在M100-S20中，对于苯唑西

林耐药金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌(MRS)，β内酰胺类药物，如青霉素类、β内酰胺/β内酰胺酶抑制

剂复合药物、头孢类(除外新型的有抗MRSA活性的头孢菌素，如ceftaroline和ceftobiprole)和碳青霉烯类体外可能敏感但临床无效，因此除了有抗MRSA活性的新型头孢菌素外，其他β内酰胺类药物的结果均需报告为耐药或不报告。 (2) 修改将金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌寄送至参考实验室确认的建议：建议将万古霉素MIC≥8μg/ml的金黄色

葡萄球菌和MIC≥32μg/ml的凝固酶阴性葡萄球菌寄送至参考实验室确认。 (3) MRSA菌株的扩展定义：MRSA指表达mecA或其他甲氧西林耐药机制(如青霉素结合蛋白对苯唑西林亲和力改

变，修饰的金葡菌，MOD-SA)的金黄色葡萄球菌。

(4) 对于对青霉素敏感但是可能产β内酰胺酶的葡萄球菌，β内酰胺酶测试试验的局限性进行了扩展讨论：对

于青霉素MIC≤0.12μg/ml或抑菌圈直径≥29mm的葡萄球菌需进行诱导性β内酰胺酶试验。然而，青霉素敏感的金葡菌很少，对青霉素敏感的菌株仍多产诱导性β内酰胺酶。因此对于严重感染，实验室应首先进行青霉素的MIC检测，而后再进行诱导性β内酰胺酶试验。

(5) 澄清了当头孢西丁和苯唑西林同时被用于测试金葡菌或路登葡萄球菌，当其中一个试验耐药时的报告建 议：当头孢西丁和苯唑西林同时被用于测试金葡菌或路登葡萄球菌时，只要其中一个耐药，即可报告“苯唑西林耐药”

33 / 48

(6) 增加利奈唑胺纸片扩散法和MIC法的“耐药”解释标准：在M100-S20中，30μg利奈唑胺纸片的纸片扩散法耐药折点为≤20mm，MIC法的耐药折点则为≥8μg/ml。

(7) 进一步讨论耐酶青霉素类的交叉敏感性：假如检测青霉素酶稳定的青霉素类药物，苯唑西林是优先选择的

抗菌药物，其结果可以用于预测其他青霉素酶稳定的青霉素类药物，邻氯西林，双氯西林，氟氯西林，甲氧西林和奈夫西林。

(8) 强调了对于苯唑西林MIC在0.5-2μg/ml的非表皮葡萄球菌的其他凝固酶阴性葡萄球菌中进行附加试验的建议：苯唑西林折点可能会高估了一些凝固酶阴性葡萄球菌的耐药性，因为一些非表皮的凝固酶阴性葡萄球菌在苯唑西林

MIC为0.5-2μg/ml时并不携带mecA基因(苯唑西林耐药折点为≥0.5μg/ml)。因此，对于苯唑西林MIC在0.5-2μg/ml的非表皮葡萄球菌的其他凝固酶阴性葡萄球菌引起的严重感染，推荐检测mecA或PBP2a或采用头孢西丁纸片扩散法。 五、其他菌种相关的更新

对于铜绿假单胞菌，M100-S20删除一条建议:“在治疗铜绿假单胞菌感染时推荐联用另一种抗菌药物(如氟喹诺

酮类药物或氨基糖苷类药物)”。对于不动杆菌属：将黏菌素和多粘菌素B从实验报告C组中删除。 对于肠球菌，修改进行β内酰胺酶试验的建议：由产β内酰胺酶导致的肠球菌耐青霉素和氨苄西林非常罕见，

因此肠球菌的β内酰胺酶不必常规检测。对于β溶血链球菌，修改有关青霉素和其他β内酰胺类药物的交叉敏感性的评论：对于A、B、C、G群β溶血链球菌，若 青霉素敏感，可认为菌株对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢拉定、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢曲松、头 孢唑肟、亚胺培南、厄他培南和美罗培南敏感。另外对于A群链球菌，青霉素敏感可认为对头孢克罗、头孢地尼、头孢丙烯、头孢布坦、头孢呋辛、头孢泊肟和头孢 匹林敏感。

对于草绿色链球菌，删除以下建议：“若菌株对青霉素敏感则可认为对其他β内酰胺类药物敏感”。并澄清表

2H-2中所涵盖的菌株：草绿色链球菌包括以下5个菌群，每个菌群包含几个菌属：可变链球菌群、唾液链球菌群、牛链球菌群、咽峡炎链球菌群(以往的米勒链球菌群)和mitis链球菌群。咽峡炎链球菌群包括小菌落A、C、F、G群β溶血链球菌。

对于脑膜炎奈瑟氏菌，在头孢噻肟和头孢曲松间加“or”。 六、关于药敏质控的更新

M100-S20中新增的药敏质控总结如表5：

七、关于药敏试验操作的更新

34 / 48

(1) 在进行稀释法药敏试验时，操作人员需要了解制备抗生素母液所需的溶解液和稀释液，M100-S20文件中增加了对三种抗菌药物母液制备所需溶解液和稀释液的注释：Besifloxacin的溶解液为甲醇，稀释液为水；Fidaxomicin的溶解液为二甲基亚砜，稀释液为水；Razupenem的溶解液和稀释液均为pH7.2，0.01mol/L磷酸盐缓冲液。

(2) M100-S20在表5B中总结了复合药物药敏试验的母液配置原则：对 于阿莫西林-克拉维酸，母液中阿莫西林和克拉维酸的浓度比应为2:1；对于氨苄西林-舒巴坦，母液中氨苄西林和舒巴坦的浓度比应为2:1；对于哌拉西林- 他唑巴坦，须保证每个药物浓度中的他唑巴坦浓度均固定为为4mg/ml，哌拉西林则对倍稀释；对于替卡西林-克拉维酸，须保证每个药物浓度中的克拉维酸浓 度均固定为为2mg/ml，替卡西林则对倍稀释；对于甲氧苄啶-磺胺甲唑，母液中甲氧苄啶和磺胺甲唑的浓度比应为1:19；对于喹奴普汀-达福普汀和 Linopristin-flopristin，由于初始药粉即制备成复合形式，故进行药敏试验时对其单药的浓度配比无要求。

八、脆弱拟杆菌群的累积抗菌药物敏感性报告

M100-S20文件的附录C对2006年1月1日至2008年12月31日从美国医院分离的脆弱拟杆菌群进行了累积抗菌药物敏感性分析并总结成表，以指导临床经验用药(见表六)：

表6. 脆弱拟杆菌群的累积抗菌药物敏感性报告

九、术语表的更新

M100-S20中，术语表I为ceftaroline和ceftobiprole增加新的抗生素亚组(有抗MRSA活性的头孢菌素组)；术语表I 和II中，将besifloxacin加入氟喹诺酮亚组，将razupenem加入碳氰酶烯亚组，将 ulifloxacin(prulifloxacin)加入氟喹诺酮亚组。

参考文献 1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twentieth informational supplement. CLSI documents M100-S20. CLSI, 2010 2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for

35 / 48

antimicrobial susceptibility testing; Nineteenth informational supplement. CLSI documents M100-S19. CLSI, 2009.

CLSI临床微生物实验室标准解读

不常见菌鉴定

CLSI 临床微生物实验室标准解读 第四辑

简介CLSI M32-A2关于临床不常见菌的简易鉴定方法

北京协和医院 陈宏斌 王辉

病原学检测对于感染性疾病的诊断和治疗非常重要，因此，临床微生物实验室在医院感染治疗和控制中起到 关键作用。目前，大部分临床微生物实验室采用商品化的鉴定系统鉴定临床分离的细菌，但是对于一些临床不常

36 / 48

见的细菌，传统的鉴定方法(如革兰染色、生化反应等)更加实用有效。因此，本文参照CLSI M32-A2文件列举了一些临床不常见细菌的特征和鉴定方法，希望对临床微生物实验室的常规工作有所帮助。 一. 不常见革兰阴性菌

1. 布氏杆菌属

布氏杆菌属是一类革兰阴性细小杆菌，牛、羊、猪等动物最易感染。人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品，均可被感染。布氏杆菌病广泛分布世界各地，我国部 分地区曾有流行。布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6个种，20个生物型。中国流行的主要是羊、牛、猪三种布氏杆菌，其中以羊布氏杆菌病最 为多见。

布氏杆菌属细菌为非抗酸性，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，呈球杆状(见图1)。血琼脂(BAP)上为透明或半透明、光滑且有光泽菌落。此细菌不在麦康凯琼脂上 生长。布氏杆菌属细菌尿素阳性，触酶、氧化酶阳性，而吲哚阴性。由于该菌属细菌具有强的传染性，因此一旦怀疑应送往LRN B级参考实验室进行确认。

2. 空肠弯曲菌

空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食物源性病原菌，认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。其致病因素包 括粘附、侵袭、产生毒素和分子模拟机制等四个方面，通过分子模拟机制可以引起最严重的并发症一格林一巴利综合征。空肠弯曲菌可以通过产生细胞紧张性肠毒 素、细胞毒素和细胞致死性膨胀毒素而致病。空肠弯曲菌对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感，但近年发现了不少耐药菌株及多 重耐药性菌株。

空肠弯曲菌菌体轻度弯曲似逗点状(见图2)。菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。微需氧菌，在含2.5～5% 氧和10% CO2的环境中生长最好，在正常大气或无氧环境中均不能生长，最适温度为37～42℃。本菌在普通培养基上难以生长，在凝固血清和血琼脂培养基上培养36 小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象。空肠弯曲生化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素。可还原硝酸盐，氧化 酶和触酶为阳性。能产生微量或不产生硫化氢，甲基红和v-p试验阴性，枸椽酸盐培养基中不生长,在弯曲菌中马尿酸呈阳性反应具有重要鉴定价值。

37 / 48

Click to enlarge

3.“HACEK”群细菌

HACEK是指一组革兰阴性杆菌：嗜血杆菌属(H)、放线杆菌属(A)、人心杆菌属(C)、艾肯菌属(E)、金氏杆菌属(K)。这组微 生物的共同特征是易导致心内膜感染，约占全部感染性心内膜炎的5-10%，它们是导致正常人群(非静脉药物滥用者)心内膜炎的常见原因之一。所有这些微生 物都是口咽部正常菌群的一部分，生长缓慢、喜好富二氧化碳环境。除心脏瓣膜感染，HACEK菌还导致其他感染：菌血症、各类脓肿、腹膜炎、中耳炎、结膜 炎、肺炎、化脓性关节炎、骨髓炎、尿路感染、伤口感染、脑脓肿、牙周感染。

嗜血杆菌属因在生长过程中需含有生长因子X(氯化高铁血红素)和(或)V(辅酶Ⅰ)的血液琼脂而得名。本属细菌为革兰阴性小杆菌，无动力，具有明显的多型 性，不形成芽胞，需氧或兼性厌氧。流感嗜血杆菌是嗜血杆菌属最重要的病原菌，镜下呈球杆状、长杆状、少数为丝状。粘液型菌株有荚膜，毒力较强。菌落一般为 光滑型，若与金黄色葡萄球菌在BAP上共同孵育，则在葡萄球菌菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落较大，这叫做“卫星现象”。原因是金黄色葡萄球菌能合成较多 的V因子，促进流感嗜血杆菌的生长。

放线杆菌属为革兰阴性杆菌，有时呈球形、椭圆形(见图3)。兼性厌氧菌，无动力，无荚膜，在含血清或血液的培养基上生长良好，37℃培养2～3天后形成直 径约1mm的菌落。在肉汤培养液中生长呈颗粒状。对人或动物致病的有伴放线放线杆菌、林氏放线杆菌和马驹放线杆菌。伴放线放线杆菌因常见于人类的某些放线 菌病的病灶中而得名。但也可单独致病，如一些亚急性细菌性心内膜炎是由本菌引起的。本属细菌能还原硝酸盐，不产生吲哚，尿素阳性。

人心杆菌是心杆菌属内唯一的种，是人的鼻腔和咽喉部的正常菌群，可引起心内膜炎、尿路感染、脑脓肿和牙周炎等疾病。大部分菌株可从血液中分离而来，有

38 / 48

的菌 株也可从脑脊液中分离而来。人心杆菌为无鞭毛、无荚膜、无芽孢，并具有多形性的革兰阴性杆菌(见图4)。革兰染色不易被脱色，单个存在或成对排列，有时形 成短链或呈葡萄状排列。该菌为兼性厌氧菌，某些菌株在初代分离时需要CO2，在生长过程中要有一定湿度，在干燥环境中不生长；在35～37 ℃均可生长，但在22 ℃或42 ℃均不生长。该菌在BAP上不溶血，经24h 培养后菌落很小，48h 后可达1mm，菌落为圆形、凸起、光滑、有光泽而边缘整齐，某些菌株的菌落可长入培养基中，使培养基表面琼脂凹陷。麦康凯琼脂上不生长。人心杆菌氧化酶阳 性，触酶阴性，吲哚阳性，不还原硝酸盐。 啮蚀艾肯菌是革兰阴性多形性球杆菌(见图5)，有一种漂白剂的气味，兼性厌氧，是口腔和许多其他粘膜表面的正常菌群。啮蚀艾肯菌是人咬伤后发生的蜂窝织炎 的病原体，它也是已发现静脉药物滥用者软组织感染和心内膜炎主要病原体。它也能导致各种各样的肺部感染(如脓胸、肺炎、败血症栓子)，类似严格偏性厌气 菌。

大多数啮蚀艾肯菌性心内膜炎患者有潜在的生物瓣膜病变。与其他HACEK菌不同，大多数啮蚀艾肯菌性心内膜炎与静脉药物滥用有关。啮蚀艾肯菌在培养基上凹陷生长，吲哚阴性，鸟氨酸阳性。

金氏杆菌属是革兰阴性球杆菌(见图6)，有3个种：

金氏金氏杆菌、产吲哚金氏杆菌、去硝化金氏杆菌，只有金氏金氏杆菌引起心内膜炎。与其他HACEK菌不同，金氏杆菌感染进展相当迅速。金氏金氏杆菌在 BAP呈大的、光滑、不透明、白色或米色、β-溶血菌落，与肠杆菌科细菌相似，但在麦康凯琼脂上不生长。金氏金氏杆菌触酶阴性，氧化酶阳性，通常分离自无 菌组织和体液。

4. 土拉热弗朗西斯氏菌

土拉热弗朗西斯氏菌简称土拉弗氏菌，是引起土拉弗氏菌病(野兔热)的病原菌。人类感染此病多因接触患病动物而致，或摄食污染食物和吸入污染空气所致。土拉 杆菌是革兰阴性多形性细菌，镜下呈球状、杆状、豆状和丝状等，无芽胞、无动力、有荚膜。该菌营养要求较高，在普通琼脂培养基和肉汤中均不生长，只在加入

胱氨酸、半胱氨酸、血液或卵黄的培养基中生长，形成圆形、光滑、灰色、凸起、有粘性的菌落，在鸡胚绒尿膜上也能生长，在卵黄囊中生长尤为茂盛，最适生长温 度35℃ ～37℃ 。若从动物或人体初次分离，一般需要3—5天。常用培养基主要有半胱氨酸葡萄糖血液琼脂平板(Francis培养基)、卵黄琼脂平板和半胱氨酸巧克力琼 脂。土拉热弗朗西斯氏菌氧化酶阴性，触酶阴性或弱阳性，β-内酰胺酶阳性。由于该菌具有强传染性，必须在生物安全柜中处理，一旦怀疑需送往LRN参考实验 室进行确认。

39 / 48

图7:脑膜炎奈瑟菌

5. 卡他莫拉菌

卡他莫拉菌为革兰阴性双球菌。过去一直认为卡他莫拉菌是对人体无致病性的上呼吸道正常寄居菌，但是，近20多年的研究发现，该菌不仅可以引起儿童和老年人 的上呼吸道感染，而且还是引起成人下呼吸道感染的重要病原菌，是儿童上颌窦炎、中耳炎、肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的第3位最常见致病菌，仅次于流感 嗜血杆菌和肺炎链球菌。卡他莫拉菌在BAP上不溶血，整个菌落可推动，氧化酶、触酶阳性，丁酸盐、吲哚酚醋酸盐阳性。

6. 奈瑟菌属

奈瑟菌属细菌为革兰阴性球菌，单个或成双排列，无芽孢、无鞭毛、有菌毛，触酶、氧化酶阳性，包括脑膜炎奈瑟菌(见图7)、淋病奈瑟菌等9种，其中有临床意 义的致病菌为脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌。BAP上呈透亮不溶血菌落，氧化酶、γ-谷氨酰氨肽酶阳性为脑膜炎奈瑟菌。BAP上呈浅灰色不溶血菌落，氧化酶、 β-半乳糖苷酶阳性为乳糖奈瑟菌。淋病奈瑟菌在巧克力琼脂上呈小的、有光泽的菌落，通常在BAP、MH和胰大豆琼脂上生长，氧化酶阳性，触酶强阳性 (30%过氧化氢)，而γ-谷氨酰氨肽酶、β-半乳糖苷酶阴性。 表1 不常见革兰阴性菌的快速鉴定方法

细菌名称 鉴定方法附加 确证试验 备注 强传染性，必须在生物安全1．细小革兰阴性球杆菌 布氏杆菌属 2．氧化酶阳性 3．触酶阳性 4．麦康凯琼脂上不生长 1．尿素阳性 2．吲哚阴性 3．BAP上不溶血 柜中处 理； 通常分离自无菌组织和体液； 需送往LRN参考实验室 1．革兰阴性杆菌，似海鸥翅膀状排列 空肠弯曲菌 2．氧化酶阳性 3．触酶阳性 4．镜下穿梭样运动 1．马尿酸盐阳性 分离自粪便标本有意义，2．吲哚酚醋酸盐阳42℃下在 性 弯曲杆菌选择培养基上生长 40 / 48

1．多形态的细小革兰阴性杆菌 人心杆菌 2．氧化酶阳性 3．触酶阴性 4．麦康凯琼脂上不生长 1．细小革兰阴性杆菌 2．CO2环境下在BAP或巧克力琼脂上菌1．吲哚阴性 啮蚀艾肯菌 落呈凹陷生长 3．氧化酶阳性 4．触酶阴性 5．麦康凯琼脂上不生长 1．细小革兰阴性杆菌或球杆菌 土拉热弗朗西斯氏菌 2．氧化酶阴性 3．触酶阴性或弱阳性 4．巧克力琼脂上缓慢生长，BAP上不生长 1．革兰阴性球杆菌 流感嗜血杆菌 2．24h后在巧克力琼脂上生长，BAP或麦康凯 琼脂上不生长 1．革兰阴性球杆菌 金氏金氏杆菌 2．氧化酶阳性 3．触酶阴性 4．麦康凯琼脂上不生长 1．革兰阴性双球菌 卡他莫拉菌 2．氧化酶阳性 3．触酶阳性 4．BAP上不溶血，整个菌落可推动 1．革兰阴性双球菌 脑膜炎奈瑟菌 2．氧化酶阳性 3．BAP上呈透亮不溶血菌落 1．革兰阴性双球菌 乳糖奈瑟菌 2．氧化酶阳性 3．BAP上呈浅灰色不溶血菌落 1．革兰阴性双球菌 淋病奈瑟菌 2．氧化酶阳性 3．触酶强阳性(30%过氧化氢) 1．γ-谷氨酰氨肽酶阴性 2．β-半乳糖苷酶阴性 1．丁酸盐阳性 BAP上溶血 ALA阴性 β-内酰胺酶阳性 2．不溶血 味 1．吲哚阳性 2．不溶血 分离自血培养、CSF才有意义，硝酸 盐阴性 如果菌落不典型，需用鸟氨3．特殊的漂白剂气酸阳性确认 强传染性，必须在生物安全柜中处理； 需送往LRN参考实验室 如果必要，需做卫星试验与布氏杆 菌属和弗朗西斯氏菌属鉴别 通常分离自无菌组织和体液 2．吲哚酚醋酸盐阳 性 γ-谷氨酰氨肽酶阳 强传染性，必须在生物安全性 柜中处理 β-半乳糖苷酶阳性 淋球菌选择琼脂上生长

二. 不常见革兰阳性菌

41 / 48

1．产单核李斯特菌

李斯特菌是一种典型的胞内寄生的革兰阳性短杆菌，共分为2个群，7个种。第一群包括产单核细胞李斯特菌、伊氏李斯特菌、无害李斯特菌(又名英洛克李斯特 菌) 、韦氏李斯特菌及西尔李斯特菌；第二群为较少见的格氏李斯特菌和莫氏李斯特菌。其中产单核细胞李斯特菌和伊氏李斯特菌具有致病性，且产单核细胞李斯特菌是 惟一能引起人类疾病的，是一种人兽共患病的病原菌，能引起人、畜的李斯特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎、流产和单核细胞增多。这种病菌在自然界广 泛存在，食品中存在的产单核细胞李斯特菌对人类的安全具有危险，世界卫生组织(WHO)指出，水产品、奶及奶制品、肉制品均有不同程度的污染，并曾将其列 为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。

产单核李斯特菌是一种革兰阳性短小杆菌，通常成双排列，偶尔可见双球状(见图8)。有鞭毛，但仅在18~20℃有动力，在37℃动力缓慢。无芽胞，一般不 形成荚膜，但在含有血清的葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜。兼性厌氧，对营养要求不高，普通培养基上可生长，在血平板上会形成β-溶血。最适的生长温度 是30~37℃，并可在4℃条件下进行冷增菌。本菌耐碱不耐酸，对热较为敏感，加热50℃10min即可死亡同时该菌对多种抗生素敏感，以氨苄青霉素为首 选，尚有青霉素、链霉素、四环素、氯霉素和红霉素等敏感。但该菌对磺胺、杆菌肽和多粘菌素耐药。产单核李斯特菌触酶阳性，马尿酸盐阳性。

2．链球菌属

链球菌属细菌广泛分布于自然界、人和动物肠道、健康人鼻咽部等，致病链球菌可引起各种化脓性炎症、猩红热、风湿热等疾病。本属细菌为革兰阳性球菌，链状排 列，无鞭毛，无芽孢，可形成荚膜，在液体培养基中易形成长链，致病性强的菌株多为长链，在脓汁标本中多为短链。本属细菌为需氧或兼性厌氧菌，部分为厌氧 菌。营养要求较高，需在加有血液、血清等成分的培养基生长良好。根据链球菌在血液琼脂平板上菌落周围溶血情况，有草绿色溶血环的称为α型溶血，如草绿色链 球菌；呈透明溶血环的称为β型溶血，称β溶血性链球菌或化脓性链球菌；也有不溶血的，称为γ型溶血，如肠球菌。根据族特异性抗原将链球菌分A－T 18个族。链球菌属细菌触酶阴性。化脓链球菌(A群) PYR阳性。无乳链球菌(B群) 马尿酸盐阳性，CAMP阳性。草绿色链球菌PYR阴性，LAP阳性，胆汁溶菌试验阴性。肺炎链球菌镜下为革兰阳性球菌，矛尖状，成双排列，在人和动物体内 形成荚膜，菌落细小、周围有草绿色溶血环，48小时后，由于菌落自溶，呈现“脐窝状”，Optochin敏感试验阳性，胆汁溶菌试验阳性，菊糖分解试验阳 性。

表2 不常见革兰阳性菌快速鉴定方法

细菌名称 初步鉴定方法 附加确证试验 备注 路登葡萄1．革兰阳性球菌，葡萄状1．PYR阳性(深红球菌 排列 色) 凝固酶玻片法可能阳性 42 / 48

2．触酶阳性 3．凝固酶试管法阴性 1．革兰阳性球菌，呈四联浅绿气球球菌或串状排列 菌 2．触酶阴性 3．α-溶血 1．细小革兰阳性杆菌 产单核李2．触酶阳性 斯特菌 3．BAP上窄的β-溶血环 4．镜下通常翻滚样运动 2．多粘菌素B耐药 3．鸟氨酸阳性 1．PYR阳性 2．LAP阴性 马尿酸盐阳性 分离自血培养或CSF才有意义 1．革兰阳性球菌，成对或1．马尿酸盐阳性 无乳链球成链排列 菌(B群) 2．触酶阴性 2．CAMP阳性 3．兰氏血清分类法如果不溶血，不要做马尿酸盐试验 3．BAP上窄的β-溶血环 为B群 咽峡炎链球菌 (\"米勒链球菌\") 1．革兰阳性球菌，成对或成链排列 2．触酶阴性 1．奶油或香草气味 2．兰氏血清分类法兰氏血清分类法也可能为A、C、F或 G群 为F群 3．BAP上菌落直径<0.5mm， 溶血不定 1．革兰阳性球菌，成对或化脓链球菌(A群) 成链排列 2．触酶阴性 菌落直径>0.5mm 1．革兰阳性球菌，呈四联1．PYR阳性 2．兰氏血清分类法因为肠球菌也可能溶血，所以应该仔细观察菌落大小和溶血情况 3．BAP上明显的β-溶血环，为A群 1．PYR阴性 2．LAP阳性 如果镜下不成链状排列，片球菌属为万古霉素菌 草绿色链球菌或串状排列 球菌 2．触酶阴性 3．α-溶血或不溶血 3．如果α-溶血，耐药，尿气球菌呈四联球菌，为尿路感染致病胆汁溶菌试 验阴性 参考文献：

CLSI M35-A2, Abbreviated Identification of Bacteria and Yeast: Approved Guideline, Second Edition

43 / 48

44 / 488:产单核李斯特菌

图

CLSI临床微生物实验室标准解读

45 / 48

碳青霉烯类折点解析

CLSI 临床微生物实验室标准解读 第五辑

2010年CLSI更新肠杆菌科细菌碳青霉烯类折点解析

陈宏斌1 王辉2

1=北京协和医院 2=北京大学人民医院

在过去的20多年中，随着头孢菌素在临床上使用的不断增加，产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的肠杆菌科细菌比率也急剧上升。碳青霉烯类抗生 素一直被作为治疗由ESBLs引起严重感染的最常用药物。目前，尽管碳青霉烯类抗生素耐药在鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中比较严重，但在肠杆菌科细菌中也 开始出现一小部分细菌对碳青霉烯类的耐药。因此，一旦出现碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistanct Enterobacteriaceae, CRE)在医院内的克隆传播，临床治疗和控制此类菌株感染将面临极大困难。2009年，JAMA杂志刊登了美国CDC关于CRE医院内感染控制的指南，由 此可见，CRE已经开始引起全世界的广泛关注。

自从肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶( K . pneumoniae carbapenemase, KPC)的出现，CRE呈现增长的趋势。世界许多国家都发现了KPC酶，这包括美国、中国、以色列、土耳其、印度、英国和北欧一些国家，在有些国家KPC 甚至发生了小的暴发流行。KPC酶不仅仅出现于肺炎克雷伯菌中，它在肠杆菌科细菌的许多菌属中都出现。OXA-48酶是流行于肠杆菌科细菌的D类碳青霉烯 类酶，主要发现于肺炎克雷伯菌，在中国、土耳其、印度和英国都报道过。B类金属酶(MBLs)主要发现于铜绿假单胞菌，但目前在肠杆菌科细菌中有不断增长 的趋势。这不仅包括以前发现的IMP、VIM等，最近在肠杆菌科细菌发现的新金属酶NDM-1更是在全世界引起轩然大波。英国科学家Timothy R Walsh首先在肠杆菌科细菌中发现了NDM-1，这种新的金属酶分离自曾经在印度新德里住院后回国的瑞典人。NDM-1一般位于质粒上，体外可以在菌株 之间稳定传播，目前已经成为一个全球性的公共卫生问题。Timothy R Walsh发表在柳叶刀上的文章报道了NDM-1的流行情况，其中印度金奈发现44株肠杆菌科细菌携带NDM-1，印度哈里亚纳邦26株，英国37株，印 度的其他城市和巴基斯坦共73株，在印度哈里亚纳邦发现的产NDM-1的肺炎克雷伯菌属于同一克隆。这些产NDM-1的菌株除了对粘菌素和替加环素敏感 外，对其他抗菌药物高度耐药。

Click to enlarge

肠杆菌科细菌对碳青霉烯类的MICs或抑菌圈直径落在中介范围内或耐药折点边

46 / 48

界时，这提示这些菌株可能携带碳青霉烯酶或者有其他碳青霉烯类 耐药的机制存在。这些菌株体外药敏表型为多利培南、亚胺培南和美罗培南的MICs在2-4 ug/mL之间，抑菌圈直径在19-22mm之间。在极有限的治疗方案选择情况下，文献中报道临床医生可能希望通过使用最大允许剂量的碳青霉烯类抗菌药物 和延长静脉输注时间来控制这些菌引起的感染。每一个临床微生物实验室应该建立一种检测和报告流程及时向临床医生报告这种菌株。这些措施可能包括电话通知临 床医生或者在实验报告中注明。临床微生物实验室与临床感染医生的沟通是非常有必要的。由于缺少可控的临床试验，采用碳青霉烯类治疗由这些中介耐药或者处于 耐药边界菌株引起的感染，临床是否有效还不确定；变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根摩根菌亚胺培南的MICs值(中介或耐药)高于美罗培南和多利培南的 MICs值，这些菌株MICs值升高不是由于产碳青霉烯酶，而是其他耐药机制。因此，CLSI基于对抗菌药物PK/PD参数、有限的临床病例资料和MIC 分布的评估，建立了肠杆菌科细菌碳青霉烯类折点新的解释标准。

以下信息是肠杆菌科碳青霉烯类新折点修订的原因：(1)文献中的研究发现，一些产KPC酶的肠杆菌科细菌碳青霉烯类的MIC值相对较低 (1-2ug/mL之间)，因此将MIC折点降到1ug/mL可以使这部分产酶株检出；2)PK/PD参数显示，在新折点MIC值以内按要求给 药，%T>MIC能够更好的达到靶值。因此，基于以上原因CLSI M100-S20更新版本修订了肠杆菌科细菌碳青霉烯类的折点(见表1)。如果实验室还没有执行新的折点标准，应该做改良odge试验(MHT)。采用新 折点后就不需要常规再做MHT，可以用于流行病学调查或医院感染控制。同时，我们也查阅了欧洲EUCAST关于肠杆菌科细菌碳青霉烯类的折点(见表2)， 尽管和CLSI更新版本中的新折点存在差异，但相对于CLSI的旧折点更加严格。

CLSI M100-S20更新版本的肠杆菌科细菌碳青霉烯类折点几乎不会造成产碳青霉烯酶菌株的漏检，但是其与临床疗效的一致性还需要更多的临床病例资料去验证。 目前，肠杆菌科细菌碳青霉烯类耐药已经在我国出现，并且在南方某些省份比较严重。因此，我们临床微生物实验室应该尽快更新自己实验室关于肠杆菌科细菌碳青 霉烯类折点，对CRE采取更加严格的院感措施，延缓CRE在我国医院内的蔓延和播散。

Click to enlarge

主要参考文献:

1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performancestandards for antimicrobial susceptibility testing; Twentiethinformational

47 / 48

supplement. CLSI documents M100-S20-U.CLSI, 2010.

2. CDC. Guidance for Control of Infections WithCarbapenem-Resistant or Carbapenemase-ProducingEnterobacteriaceae in Acute Care Facilities. JAMA,2009,301 (19):1979-1982.

3. Kumarasamy KK, Toleman MA, Walsh TR, Bagaria J, ButtF, Balakrishnan R, Chaudhary U, Doumith M, Giske CG,Irfan S, Krishnan P, Kumar AV, Maharjan S, Mushtaq S, Noorie T,Paterson DL, Pearson A, Perry C, Pike R, Rao B, Ray U, Sarma JB,Sharma M, Sheridan E, Thirunarayan MA, Turton J, Upadhyay S,Warner M, Welfare W, Livermore DM, Woodford N. Emergence of anew antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK:a

molecular, biological, and epidemiological study. Lancet Infect Dis. 2010 Sep;10(9):597-602.

4. http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/

48 / 48