细菌的简单染色和革兰氏染色实验

细菌的简单染色和革兰氏染色实验

实验目的

1. 学习微生物涂片，染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。、

2. 巩固显微镜的使用方法。

基本原理

1. 简单染色法:用单一染料对细菌进行染色的方法。此法操作简单，适用于一般形态的观察。在中性，碱性或酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而是细菌着色。带正电的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。通常的碱性染料除了美蓝外，还有结晶紫，碱性复红，番红等。细菌体积较小，较透明，如未经染色常不易识别，而经染色后与背景形成鲜明的对比，是易于在显微镜下观察。

2. 革兰氏染色法:将所有的细菌分成革兰氏阳性菌G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌上最常用的鉴别染色法。该染色法所以将细菌分为G+和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同决定的。

G-菌的细胞壁中含有较多易被乙酸溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使染色的结晶紫和碘的复合物易于渗透，结果细菌被脱色，在经复红染色后就成了红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时颜色。

革兰氏染色需要四种不同的溶液，碱性染料初染液，煤染剂，脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或付着力，即已某种方式帮助染料固定在细胞上，是不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染剂，复染的目的是使被脱落的细胞染上不同于初染液的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的染色液是复红。

器材

1. 活材料，培养24小时的大肠杆菌和葡萄球菌。

2. 染色液和试剂，碱性美兰，结晶紫，碘页，95%酒精，石炭酸复红，蒸馏水，乙醚-乙醇混合液，香柏油。

3. 器材，废液缸，洗瓶，载玻片，接种杯，酒精灯，擦镜纸和显微镜。

操作步骤

1. 涂片，取干净的载玻片与实验台上，在正面边角作记号，并滴一滴无菌蒸馏水与载玻片中央，灼烧接种杯，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混均后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

2. 干燥，干燥过程最好在空气中自然晒干，为了加速干燥，也可以在微小火焰上方烘干。烘干后再在火焰上方快速通过3-4次，使菌体完全固定在载玻片上。但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。

3. 染色，滴加草酸铵结晶紫染色1-2min,染色液量以盖满菌膜为宜。

4. 水洗，倾去染液，斜置载玻片，用水冲去多余染液，直至流出的水呈无色为止。

5. 干燥，用微热烘干或自然晾干。

6. 镜检，按显微镜的操作步骤观察细菌形态，及时记录，并进行形态图绘制。

革兰氏染色

各种细菌经革兰氏染色法染色后，能区分成两大类，一类最终染色成紫色，称为革兰氏阳性细菌G+,另一类被染成红色，称革兰氏阴性细菌G-。

操作步骤

1. 涂片，固定。同简单染色法。

2. 初染

滴加草酸铵结晶紫染色1-2min,水洗。

3. 媒染

滴加革兰氏碘液，染1-2min,水洗。

4. 脱色

滴加体积分数为95%的乙醇，约45S后水洗；或滴加体积分数为95%的乙醇后将玻片摇晃几下即倾去乙醇，如此重复2-3次后即水洗。

5. 复染

滴加沙皇液(番红)，染2-3min,水洗并使之干燥。

6. 镜检

同简单染色，并根据呈现的颜色判断该菌属是G+细菌还是G-细菌，也可与已知菌对照。观察时先用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察。

注意事项

1. 涂片所用载玻片要洁净无油污迹，否则影响涂片。

2. 挑菌量应少些，涂片易薄，过厚重叠的菌体则不易观察清楚。

3. 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩去玻片上的残水以免染色液被稀释而影响染色效果。

4. 革兰氏染色成败的关键是脱色时间时候合适，如果脱色过度，革兰氏阳性细菌也可

以被脱色而被误认为是革兰氏阴性细菌。而脱色时间过短革兰氏阴性细菌则会被误认为是革兰氏阳性细菌。脱色时间的长短还受涂片的薄厚，脱色时玻片晃动的程度等因素的影响。