土壤中淀粉酶产生菌的筛选

微

生物实验报告 ——馒头、圣女果及柚子皮上产淀粉酶的微生物的筛选

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一、实验目的

1. 巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。 2. 练习微生物接种、移植和培养的基本技术。 3. 学习并掌握分离纯化微生物的基本操作。 二、实验原理

芽孢杆菌 （Bacillaceae）， 细菌 的一科，能形成芽孢（ 内生孢子 ）的杆菌或 球菌 。包括芽孢杆菌属、 芽孢乳杆菌属 、梭菌属、 脱硫肠状菌属 和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子 抵抗力 强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌bacillus 杆菌科的一属能产生淀粉酶的细菌。我们小组利用芽孢杆菌能够分解淀粉酶的特征，从柚子皮、圣女果、馒头上分离芽孢杆菌，并取得良好的效果。在本次试验中，我们将柚子皮、圣女果、馒头上收集了菌种进行培养、分离、纯化、鉴定，最后利用产淀粉酶的菌种与碘液能产生水解圈，并对能产生水解圈的菌种进行革兰氏染色观察、芽孢观察等。此外，选择芽孢杆菌进行试验还取决于它的特性：1.繁殖快速：代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。2. 生命力强：无湿状态可耐低温－60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厌氧繁殖）。3.体积大：体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。 芽孢是休眠体，不是繁殖体。

绝大多数是一个菌体仅形成一个芽孢芽孢位于菌体内,由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成。在显微镜下进行芽孢观察时，还应注意染色问题。 三、实验仪器及药品

1．样品：馒头、圣女果、柚子皮 2．培养基：牛肉膏蛋白胨淀粉培养基

3．溶液和试剂：0.5%番红染液、5%孔雀石绿染液、95%乙醇、1%结晶紫染液、卢戈氏碘液、蒸馏水等。

4．仪器和其他用品：酒精灯、试管、三角瓶、培养皿、载玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、接种环、试管夹、镊子、滤纸、滴管等。 四、实验步骤

1. 产淀粉酶微生物的培养：将馒头在28℃ 温箱中与少量土壤混合培养。

将变质圣女果继续培养至能肉眼可见菌落。 将霉变的柚子皮放入28℃温箱中继续培养。 2. 灭菌消毒：将洁净的试管20支，平板25个，三角瓶两个包扎并于121℃、0.1MPa下用高压灭菌锅灭菌。

3. 制作平板：采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL

蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板。

4. 划线接种：（由于圣女果，馒头，橘皮上长出菌株较少，所以我们采用直接接种）分别将馒头、圣女果、橘皮上生长的菌落用分区划线法分别接种到六个平板的上。

5. 鉴定水解圈：将上述培养基培养24小时后，将其取出，将平板上的菌落用牙签挑到另一个洁净的平板培养基上。然后用卢戈式碘液检验，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有透明的水解圈，说明该菌能分解淀粉，即能产生淀粉酶。将事先接种的平板标记并培养。 6. 纯化：将能产生水解圈的菌种用无菌操作法接种到斜面上。 7．培养：将上述斜面培养24小时。

8．鉴定一：将其中一管斜面先用革兰氏染色法染色，看其为革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌。记录其形态。

① 涂菌及固定：在干净载玻片上滴一滴蒸馏水，通过无菌操作用接种环涂菌在载玻片上，等其自然干燥后，在酒精灯火焰上过二至三次。 ② 初染及冲洗：滴一至两滴结晶紫，染色1分钟。然后开小股水流冲洗载玻片至流出的水无色为止。

③ 媒染及冲洗：滴一至两滴卢戈氏碘液，染色1分钟。然后按上述方法冲洗载玻片至流出来的水无色为止。

④ 脱色及冲洗：滴加95%的乙醇溶液，脱色15—18秒。同上方法冲洗载玻片。

⑤ 复染及冲洗：滴加一至两滴番红染液，染色2分钟。同上方法冲洗载玻片。

⑥ 镜检：在显微镜下仔细观察，记录结果。

9. 鉴定二：再过24小时（即斜面培养48小时）后，即可进行芽孢染色鉴定。（加热染色和改良法） 加热染色法：

① 涂菌及固定：在干净载玻片上滴一滴蒸馏水，通过无菌操作用接种环涂菌在载玻片上，等其自然干燥后，在酒精灯火焰上过二至三次。 ② 加热染色：向载玻片上滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用镊子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸气并维持10分钟，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。

③ 复染及冲洗：用0.5%番红水溶液复染2分钟。用小股自来水冲洗载玻片至流出来的水无色为止。 ④ 镜检：将载玻片晾干后油镜镜检。 改良法：

① 制备菌液：加水2至3滴于小试管中，用接种环从斜面上挑取较多的菌于试管中，充分混匀，使成较浓的菌液。

② 加染料：加5%孔雀绿液（约0.3-0.4ML）于试管中，充分混合。 ③ 加热：将此试管浸于沸水浴中，加热15-20分钟。

④ 涂片及固定：从试管中携菌液于洁净的玻片上，涂成薄膜。并在微火上过3次。

⑤ 冲洗：用小股水流冲洗至流出来的水无色为止。 ⑥ 复染：用番红溶液复染1分钟。 ⑦ 倾去染液后，用吸水纸吸干。然后镜检。

五．实验结果

1、在第二次倒平板时，圣女果和馒头组分别出现了明显的水解圈，而柚子皮的则没有。

圣女果上的菌体水解圈

馒头上的菌体水解图

柚子皮上的菌体无水解圈

1、 在用斜面上的菌进行革兰氏染色（沙黄和番红）的过程中发现： （1） 圣女果斜面：有呈蓝紫色杆状和粗杆状的细菌，也有呈红色的

杆状菌体。

（2） 馒头斜面：呈红色的杆状菌。

2、 从圣女果的第一个斜面提纯以后再进行革兰氏染色，发现呈红

色长杆状细菌。

3、 芽孢观察

（1） 圣女果的第二次斜面（提纯）组：有绿色的芽孢，红色的呈杆

状细菌。

（2） 馒头的第一次斜面（改良法）：有少量芽孢，呈绿色。

六．分析与讨论

实验前期，由于馒头上长时间无菌种，我组将土壤与馒头混合培养以获得菌种。而圣女果上已有黑色与白色两种形态不同的菌种，但菌种较少，所以我们采用了直接接种，而不是梯度法稀释。这样造成了首次接种菌落不纯的后果。但我们鉴定出能产淀粉酶的菌株后采用多次接种纯化，最终得到了菌种较纯的斜面与平板。实验鉴定时由革兰氏染色鉴定出所选菌株有阴性菌也有阳性菌，但纯化得到得菌种从外形上观察为杆菌。初步判断为芽孢杆菌，鉴定芽孢杆菌时选用了两种方法，一是老式的芽孢鉴定法，二是改良的芽孢鉴定法。都鉴定出了产芽孢的杆菌。

通过本次试验，我们学会了初步提取并鉴定目标菌种的方法。该实验要求我们具有团结互助的实验精神和熟练的实验操作技术。