硕士学位论文
絮凝-离心-微滤技术处理大豆乳清制取蛋白
及其性质的研究
SEPARATION AND THE PROPERTIES OF WHEY PROTEIN
FROM SOYBEAN BY
FLOCCULATION-CENTRIFUGATION-MICROFI-LTRATION
高长永
哈尔滨工业大学 2011年6月
国内图书分类号：Q512.1 学校代码：10213
国际图书分类号：600 密级：公开
工学硕士学位论文
絮凝-离心-微滤技术处理大豆乳清制取蛋白
及其性质的研究
硕士研究生： 高长永 导 师： 张兰威 教授 申请学位： 工学硕士 学
科： 食品科学
所 在 单 位： 食品科学与工程学院 答 辩 日 期： 2011年6月25日 授予学位单位： 哈尔滨工业大学
Classified Index: Q512.1 U.D.C: 600
Dissertation for the Master Degree in Engineering
SEPARATION AND THE PROPERTIES OF WHEY PROTEIN FROM SOYBEAN BY FLOCCULATION-CENTRIFUGATION-MIC
ROFI-LTRATION
Candidate：
Changyong Gao
Supervisor： Speciality：
Prof. Lanwei Zhang Food Science
Academic Degree Applied for： Affiliation： Date of Defence：
Master of Engineering
School of Food Science and Engineering June，25th, 2011
Degree-Conferring-Institution： Harbin Institute of Technology
摘 要
大豆乳清是生产大豆分离蛋白的废弃物，其生物化学需氧量和化学需氧量值是我国废水排放标准的10倍。每年我国排放的大豆乳清量约为2亿m3，这些乳清直接排放不仅造成资源的浪费，而且严重污染环境。本研究针对社会公益要求和生产企业需要，对大豆乳清处理提取乳清蛋白的技术及其性质做了深入研究。
大豆乳清的预处理实验研究表明，采用3000³g，15min的离心方法预处理大豆乳清是行之有效的，可以获得成分稳定的乳清，其蛋白质含量为1.431±0.090 g/L，灰分含量为4.00±0.07 g/L。
絮凝-离心法沉降大豆乳清蛋白实验中，通过对比14种絮凝剂对乳清蛋白的絮凝率、絮凝组分的选择效果，选出了絮凝剂LT，它对蛋白质絮凝率为90%；以及可选择性絮凝脂肪氧化酶和β-淀粉酶的絮凝剂LL。为了确定这两种絮凝剂的复配可行性，研究了复合絮凝剂LT-LL对乳清蛋白的絮凝效果，实验表明复配絮凝剂的蛋白絮凝率为50%左右，与絮凝剂LT的蛋白絮凝率相比显著降低，故两者不具有复配性。对单一絮凝剂LT絮凝乳清蛋白的絮凝条件的单因素和正交实验研究表明，絮凝剂LT的最佳絮凝条件为：体系pH 3.0，絮凝剂添加量为2.5 g/L，体系温度为25℃。经3000³g，15 min离心后，蛋白质去除率为93.86%。
絮凝-微滤法分离浓缩乳清蛋白中，研究了11种絮凝剂对蛋白质凝集体粒径的影响，选出了絮凝剂LT和絮凝剂LX，它们分别将凝聚体粒度由109 nm提高至436和443 nm。絮凝剂LX絮凝条件的研究表明，其最佳的絮凝pH范围为7-8，与乳清原始pH 4.5显著差异。絮凝剂LT添加量与乳清蛋白凝聚体粒径提高程度的研究表明，最佳添加量为0.02 g/L，此时凝聚体粒度为436 nm。絮凝蛋白的微滤实验结果表明，膜分离最佳工艺条件为体系温度控制在40-50℃之间，压力为0.2 MPa，操作时间控制在70 min以内时，膜可保持较高的
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膜渗透通量，较低的透过液蛋白质浓度的状态。此时的膜渗透通量为319.83 L/(m2²h)，透过液蛋白质浓度为6.21 mg/L。
最后，研究了絮凝-微滤分离的乳清蛋白的性质。实验结果表明，在pH 3附近溶解度较好，为8.6%。其热变性温度为84.74℃。灰分含量为86.01±0.52%。脱盐方法的研究表明：与超滤法相比，透析脱盐法更适合应用于大豆乳清蛋白的脱盐中。
本研究的絮凝-离心法和絮凝-超滤法均能有效分离制取乳清蛋白，为大豆乳清废液及其他废水的处理提供了一定的理论和方法依据。
关键词：大豆乳清蛋白；絮凝；离心；微滤；性质
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Abstract
During the production of soy protein isolates, an industrial organic
wastewater called “soy whey” also was generated. Its biochemical oxygen demand and chemical oxygen demand were 10 times more than the wastewater discharge standards. Every year, about 200 million m3 soy whey was discharged in our country. If those whey is direct discharged, both of the resource-wasting and environmental pollution must be huge. Owing to the requirements of social and the needs of companies, sepration methods and the properties of whey protein from soy whey were studied.
In this study, whey soy protein (WSP) was pretreated by the method of
centrifugation. The optimum technological parameter was 3000×g, 15min. The protein retained consistensy was 1.431 ± 0.090 g/L, and the ash was 4.00±0.07 g/L.
In the experiments of whey soy protein’s flocculation, by examed fourteen
flocculants’ flocculation rates and flocculation selectivities, flocculant LT was selected as its effective ability. And its flocculation rate was 90%. The flocculant LL also was chose for its selective flocculation ability of lipoxygenase and β-amylase. Then the experiments of coagulant LT-LL’s ablitity showed that the flocculation rate of compound flocculants was 50%. But it significant lower than flocculant LT’s. The research in the flocculation conditions of flocculant LT with WSP showed that the optimum technological parameters were existed. The system pH was 3.0 and the temperature was 25℃. LT’s addition level was 2.5 g/L. By flocculation in this parametrs and centrifugation in 3000×g,15min, the protein removal rate was 93.86%.
In the research of separation and concentration of WSP by the method of
flocculation-microfiltration, eleven flocculants’ ability in increasing the size of protein aggregates were studied. According to the results and the availability in membrane, flocculant LT and flocculant LX were selected. Both of them can increase the size form 109 nm to 436 and 443 nm . Through the experiment in LX, its the best flocculation pH range of 7-8 was found. Considering soy whey’s pH was 4.5, it was not chose as a suitable flocculant. After the research of the relationship between flocculant LT dosage and protein particle size, The optimum dosage was 0.02 g/L. In the followed membrane process, the optimum technological parameter was system temperature 40-50℃, press 0.2 MPa, and in 70 min, the membrane maintained a high flux, low protein concentration of the permeate. At this point the membrane flux was 319.83 L/(m2•h)and the protein concentration was 6.21 mg/L.
In study of WSP gathered by the method of flocculation- microfiltration,
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experimental results showed that WSP optimum solubility pH is 3, and the solubility was 8.6%; protein thermal denaturation temperature was 84.75℃; and the ash was 86.01±0.52%. In the followed research, we tested the desalination effects of two kinds of desalination methods. The results were that dialysis was more suitable than ultrafiltration for desalination.
By doing this study, two methods of flocculation-centrifugation and
flocculation-microfiltration were got. They can efficiently separate whey soy protein from the waste. And this study can provide a certain amount of theoretical and methodologiccal basis for the treatments of soy whey and other waster water too.
Keywords: WSP; flocculation; centrifugation; microfiltration; properties
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目 录
摘 要 .......................................................................................................................... I ABSTRACT ............................................................................................................... III 目 录 ........................................................................................................................ V 第1章 绪 论 ........................................................................................................... 1 1.1 课题背景及研究的目的和意义 ................................................................. 1 1.2 大豆乳清及乳清中的蛋白质 ..................................................................... 2
1.2.1 大豆乳清中的主要活性成分 ................................................................... 2 1.2.2 大豆乳清蛋白 ........................................................................................... 3 1. 3 絮凝法回收蛋白质的研究进展................................................................. 6 1.4膜分离技术概述 ........................................................................................ 7 1.4.1 膜分离技术简介 ....................................................................................... 7 1.4.2 膜分离的原理 ........................................................................................... 7 1.4.3 膜污染的流体动力学研究 ....................................................................... 8 1.4.4 利用膜技术回收蛋白研究进展 ............................................................... 9 1.5 蛋白质脱盐方法的研究进展 ................................................................... 10 1.6 本论文的研究内容 ...................................................................................11 第2章 材料与方法 ............................................................................................... 13 2.1 实验材料 ................................................................................................. 13 2.1.1 主要试剂 ................................................................................................. 13 2.1.2 主要仪器设备 ................................................................................... 14 2.1.3 实验原料 ................................................................................................. 15 2.2 实验方法 ................................................................................................. 16 2.2.1 蛋白质浓度的测定 ................................................................................. 16 2.2.2 灰分含量的测定 ..................................................................................... 17 2.2.3 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 .......................................................... 18 2.2.4 大豆乳清蛋白的粒度测定 ..................................................................... 18 2.2.5膜实验 ...................................................................................................... 18
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2.2.6 大豆乳清蛋白性质的测定及脱盐方法的研究 ..................................... 19 第3章 大豆乳清的预处理研究 ............................................................................. 22 3.1 引言 ........................................................................................................ 22 3.2 大豆乳清预处理条件的研究 ................................................................... 22 3.3预处理后主要物质含量的测定 ................................................................ 23 3.3.1总蛋白质含量的测定 ........................................................................ 23 3.3.2灰分的测定 ....................................................................................... 24 3.4 本章小结 ................................................................................................. 24 第4章 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究 ........................................................ 25 4.1 引言 ........................................................................................................ 25 4.2 絮凝剂的选择 ......................................................................................... 25 4.3影响絮凝剂LT絮凝效果的单因素研究 .................................................. 30 4.3.1 PH对絮凝效果的影响....................................................................... 30 4.3.2温度对絮凝效果的影响 .................................................................... 31 4.3.3添加量对絮凝效果的影响 ................................................................. 31 4.4 絮凝剂LT絮凝最佳工艺条件的确定 ...................................................... 32 4.5 本章小结 ................................................................................................. 34 第5章 大豆乳清蛋白的絮凝-微滤研究 ................................................................ 35 5.1 引言 ........................................................................................................ 35 5.2絮凝剂的选择 .......................................................................................... 35 5.2 絮凝剂的絮凝条件研究 .......................................................................... 37 5.2.1 絮凝剂LT絮凝条件研究 .................................................................. 37 5.2.2 絮凝剂LX预絮凝条件研究 ............................................................. 38 5.3 截留浓缩大豆乳清蛋白的微滤实验研究 ................................................. 39 5.3.1 微滤膜的选择 ................................................................................... 39 5.3.2 新膜初始水通量的测定 .................................................................... 40 5.3.3 料液温度、连续工作时间对渗透通量和透过液蛋白质浓度的影响 . 40 5.4 本章小结 ................................................................................................. 41 第6章 大豆乳清蛋白的性质测定及脱盐方法研究 ............................................. 43 6.1 引言 ........................................................................................................ 43 6.2 大豆乳清蛋白的溶解度 .......................................................................... 43 6.3 大豆乳清蛋白的热稳定性 ....................................................................... 44 6.3 大豆乳清蛋白的灰分含量 ....................................................................... 45
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6.4 大豆乳清蛋白的脱盐方法研究 ............................................................... 45 6.5 本章小结 ................................................................................................. 46 结 论 ....................................................................................................................... 47 参考文献 ................................................................................................................... 48 附录 ........................................................................................... 错误！未定义书签。 哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性声明 ........................... 错误！未定义书签。 哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书 ........................... 错误！未定义书签。 致 谢 ....................................................................................................................... 53
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学位论文 绪论 第1章 绪 论
1.1 课题背景及研究的目的和意义
大豆在我国不但种植广泛，并且用于生产豆腐、豆豉、豆皮等食品的历史至今已有两千多年。近些年，我国科学技术得到了迅猛的发展，人们对饮食与健康之间的关系的认识也随之加深。对大豆成分的研究表明，大豆中蛋白质含量高于谷类和薯类食品2.5-8倍，是优质丰富的植物蛋白质来源。目前对大豆功能特性的研究显示，大豆具有降低血脂血糖、降血压、防癌抑癌、增强骨质、改善绝经综合症等8项功能[1, 2]。对大豆功能性成分的深入研究，也引起了大众对大豆综合开发利用的日益关注。1994年，我国提出了在城乡实施“大豆行动计划”的意见，由此拉开了我国大豆的综合开发、利用的序幕。2006年，“双蛋白”概念和“双蛋白”战略在“第二届中国大豆食品产业圆桌峰会上”首次提出。与会专家提出，依托我国的国情，借鉴国外的先进理念，科学继承、发扬我国以优质植物蛋白为主要膳食蛋白质的传统饮食文化，实施两种不同来源蛋白质食品优势互补的食品科学发展战略[3, 4]。
大豆分离蛋白生产过程中，营养成分会不同程度的流失。这部分营养成分及生物活性物质主要有大豆乳清蛋白、大豆低聚糖、异黄酮、皂苷等。若以蛋白质溶解性为分类标准，大豆蛋白分为乳清蛋白和大豆球蛋白两类。其中，大豆球蛋白约占总蛋白含量的90%，包括大豆分离蛋白、组织蛋白、浓缩蛋白等蛋白质，这些蛋白质也是以往大豆蛋白质研究领域的重点。大豆乳清蛋白约占大豆总蛋白的5%，即大豆乳清蛋白。这部分蛋白是生产大豆分离蛋白过程中豆粕碱提酸沉后，依旧溶解在清液的蛋白质的统称。这些物质通常以乳清液的为排放载体而排放，既造成了资源的浪费，也严重污染了环境。据统计，国内大豆分离蛋白企业每年的大豆废水排放量多达300万吨以上，随着经济的发展、企业的增多，排放量肯定会大幅增加。如不对乳清废水做处理，对环境的污染将不堪设想。
近些年，科学技术的进步，人们环保意识的加强使得对大豆乳清进行相应处理，回收其中有效成分的工作迫在眉睫。本文通过对大豆乳清蛋白絮凝剂的筛选、絮凝条件的研究，确定了最佳的大豆乳清蛋白絮凝剂及其絮凝条件；通过絮凝剂与乳清蛋白的絮凝特性，选出了能高效提高蛋白质凝聚体粒度的絮凝剂，并随后对其进行了微滤实验，得到了相应的膜动力参数；然后对截留液乳清蛋白的性质进行了研究。此研究的结果既有利于回收了乳清蛋白，又为减轻
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学位论文 绪论 乳清排放造成的污染做了一定的贡献。
1.2 大豆乳清及乳清中的蛋白质 1.2.1 大豆乳清中的主要活性成分
大豆乳清中大约包含1.5%的固形物。这些固形物中包括多种相当数量的活性成分，如乳清蛋白、大豆低聚糖等。下面将对这些主要成分进行简单的概述。 1.2.1.1 大豆乳清蛋白（Whey soy protein）
大豆乳清蛋白主要是大豆蛋白中的2S、7S组分，含有β-淀粉酶、凝血素、磷酸酶植酸、胰蛋白酶抑制剂、细胞色素C等很多生理活性物质[5-8]。各组成部分的分子量和等电点如表1-1所示。
表1-1大豆乳清蛋白组成成分的分子量及等电点
组分
2S 7S
成分 Kunitz抑制剂 Bowman-Birk抑制剂
细胞色素C 血球凝集素 脂肪氧化酶 β-淀粉酶
相对分子量 21500 7985 12000 120000* 102000 61700
等电点 4.5 4.2 9.8-10.1 5.81 5.68 5.85
注：*由4个相同分子量为3000的亚基组成
1.2.1.2 大豆低聚糖（Soybean oligosaccharides）
大豆低聚糖（SOSB）是大豆中所含可溶性碳水化合物的总称，它是α-半乳糖苷类，主要由水苏糖四糖、棉子糖和蔗糖等组成。其中，蔗糖占低聚糖总量的39%左右，水苏糖占24%，棉籽糖则占8%[9]。大豆低聚糖具有降低血清胆固醇[10]、抗癌抗肿瘤[11]、促进钙的吸收、降血压、抗衰老、改善皮肤过敏等功效。如今，大豆低聚糖已被广泛应用于食品加工过程中，这部分食品主要有乳制品、软饮料、巧克力、粮油制品等。
1.2.1.3 大豆异黄酮（Soybean isoflavone）
大豆异黄酮主要包括5,7,4-三羟基黄酮、大豆甙元、大豆黄素，其结构和
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学位论文 绪论 17-β-雌二醇很相似[12]。它们的结构见图1-1所示。也称“植物雌性激素”，作为生物活性最强的大豆提取物，受到了广泛深入的研究。它具有一定的雌激素功效[13]。国外学者的研究表明，大豆异黄酮具有防止骨质疏松的功能[14, 15]。并且，它还具有维持雌性激素水平、抗血管增生降低前列腺癌等活性[16]。也正是由于它具有的特性，使得其被广泛应用在保健领域[17]。
图1-1 大豆异黄酮结构图
1.2.1.4 大豆皂苷（Soy Saponins）
大豆皂苷是一种分子量为1000左右的两性三萜酸性皂苷。之前一直因为其抑制生长的特性而被认为是豆制品加工中该被除掉的一种抗营养因子。近期研究表明，它具有增强免疫调节能力、抗癌、清除自由基等功效。它能与富含磷脂和胆固醇的癌细胞膜相互作用，影响癌细胞的生长，造成细胞凋亡[18]。另外，由于具有对健康有益的活性功能，大豆皂苷具有广泛的开发应用前景。比如，以其具有发泡和乳化性，现已被应用于食品当中[19]。
1.2.2 大豆乳清蛋白
由表1-1可知，大豆乳清蛋白是多种蛋白的统称，主要由胰蛋白酶抑制剂、细胞色素C、大豆血球凝集素、脂肪氧化酶和β-淀粉酶组成。下面将依次介绍这些蛋白质的性质，以说明对乳清蛋白进行回收利用的必要性。 1.2.2.1 胰蛋白酶抑制剂（Trypsin Inhibitors）
胰蛋白酶抑制剂也是大豆中的一种抗营养因子，是一种含有72-197个氨基酸残基的具有胰蛋白酶抑制作用的多肽或者蛋白质[20],在大豆中约有7-10种胰蛋白酶抑制剂[21]。按照氨基酸序列的同源性可以分为两类：Kunitz类胰蛋白酶
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学位论文 绪论 抑制剂(Kunitz trypsin inhibitors, KTIS)的活性中心为Arg63和Ile64，分子内有两个二硫键(Cys39-Cys86,Cys138-Cys145)，相对分子量为20000。其结构为12个反平行β带十字交叉构成的直径约为3-5nm的球体。它属于β折叠蛋白，具有特殊的热稳定和化学稳定性。每个KTIS分子可以钝化一分子的胰蛋白酶[22,
23]
，其结构见图1-2。它在大豆中的含量约为0.6%；另一类为Bowman-Birk类
胰蛋白酶抑制剂（Bowman-Birk inhibitors, BBI），相对分子量为7985，由71个氨基酸组成，含有7个二硫键[24, 25]，能在两个活性位点同时抑制胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。BBI抑制胰蛋白酶的位点为赖氨酸16-丝氨酸17；抑制胰凝乳蛋白酶的位点为亮氨酸44-丝氨酸45[26]，其结构见图1-3。它在大豆中约占1.4%。
虽然胰蛋白酶抑制剂一直被认为是传统意义上的抗营养因子，但现在的研究表明，BBI具有抗癌作用，虽然抗癌的机理还不清楚[27]。同样低浓度的BBI可保护组织免受辐射、自由基损伤，并具有降低胆固醇的功效。
图1-2 Kunitz胰蛋白酶抑制剂结构 图1-3 Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂结构
1.2.2.2 细胞色素C（Cytochrome C）
细胞色素C是一种保守蛋白质，定位在线粒体内膜外侧，存在于所有含线粒体呼吸链的生物中。它是线粒体呼吸链中的一种重要电子载体。除了具有电子传递功能以外，近期实验研究发现，细胞色素C在细胞的凋亡和抗氧化方面也有重要的作用。临床上用于急救或辅助治疗各种原因引起的组织缺氧，如一氧化碳中毒，安眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉前处理及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧等，亦可用于脑缺氧、中毒性心肌损害、心肌炎、心肌代偿不全、心绞痛、心肌梗塞、肝炎、肾炎等[28]。
细胞色素C从结构上看，分子形态近似球形，直径约为3.4 nm。作为研究最透彻的细胞色素，它的氨基酸序列和三维空间结构已被阐明[29]，如图1-4所示。
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学位论文 绪论
图1-4 细胞色素C空间三维结构
1.2.2.3 大豆血球凝集素（Soybean Agglutinin）
大豆血球凝集素是一类对N-乙酰基D-半乳糖胺/D-半乳糖有特异性结合作用的糖蛋白，也是大豆中的一种抗营养因子。它的分子量约为120000D，具有豆类凝集素的四级结构，是4个亚基的聚体，每个亚基分别有一个糖结合位点，如图1-5所示。
图1-5 大豆血球凝集素的四级结构图
长期以来，对大豆凝集素的研究主要停留在其抗营养方面。但近20年来，因大豆凝集素的糖蛋白属性和特异性结合寡糖或其衍生物的特性，使其在糖生物化学、血型鉴定、细胞识别、靶向给药等领域有光明的前景[30]。 1.2.2.4 脂肪氧化酶（Lipoxidase）
脂肪氧化酶是一种单一的含有非血红素铁的，球形、无色，内部不含硫的过氧化物酶。脂肪氧化酶可以催化含有顺-1,4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸和脂肪酸脂[31]。通常，大豆脂肪氧化酶都与豆制品的豆腥味紧密相连。但也有研究
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学位论文 绪论 表明，它对胡萝卜素有漂白作用。把它加入到面粉中可以漂白面粉[32]。 1.2.2.5 β-淀粉酶（β-amylase）
β-淀粉酶是大豆中大量存在的“外切”型糖化酶，只能从非还原末端顺次切割麦芽糖。该酶除了可用于测定淀粉及其衍生物结构外[33]，还广泛被应用在葡萄糖浆、啤酒生产、食品制造、制药业等领域[34]。
1. 3 絮凝法回收蛋白质的研究进展
絮凝法主要是利用絮凝剂带有正（负)电性的基团中和一些水中带有负(正）电性难于分离的一些粒子或者叫颗粒作用，降低其电势，使其处于不稳定状态，并利用其聚合性质使得这些颗粒集中。
絮凝剂按照其化学成分总体可分为无机絮凝剂（按金属盐可分为铝盐系及铁盐系两大类；铝盐以硫酸铝、氯化铝为主，铁盐以硫酸铁、氯化铁为主。）和有机絮凝剂两类。其中无机絮凝剂又包括无机凝聚剂和无机高分子絮凝剂；有机絮凝剂又包括合成有机高分子絮凝剂、天然有机高分子絮凝剂和微生物絮凝剂。
乳清蛋白分离方法包括色谱层析、电渗析、膜过滤、以及酸度和温度调节法[35] 。上述方法在实验室内基本可以实现较好的蛋白分离，但产率低、纯度不高和高成本的缺点限制了这些方法的实际应用。因此寻找新型絮凝剂，通过絮凝法回收乳清蛋白对于乳清的合理利用有重要意义 。国内外学者使用絮凝法回收蛋白质的研究有：
刘秉涛等（2005）采用壳聚糖絮凝回收蛋白废水中的蛋白质。实验表明，壳聚糖在pH 6的条件下，能够很好的絮凝回收蛋白质，豆浆和奶粉模拟水样浊度的去除率分别为95%和88%。壳聚糖对粗蛋白的平均回收量为25-28 g/g[36]。
方志民等（2008）研究了海产品加工废水中蛋白质的回收。实验中，他们采用壳聚糖、Al2(SO4)3、硫酸铁、聚丙烯酰胺回收蛋白质。实验表明，壳聚糖相比于其他三种絮凝剂，在较低浓度下就可以达到较高的蛋白质回收率和出水透光率。在采用 100 mg/ L 的硫酸铝、100 mg/ L 的硫酸铁和 40 mg/ L 的壳聚糖复合絮凝剂对蛋白质进行回收时，蛋白回收率达到 72%以上，粗蛋白含量为 79. 7 %[37]。
刘伟等（2010）用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）絮凝乳清蛋白，并研究了CTAB添加量、溶液的pH值、温度、离子强度、蛋白质浓度对蛋白质回收率的影响。研究表明：当CTAB浓度为5 mmol/L、pH为8.0、温度为80℃、蛋白质浓度为0.6 g/100ml时，蛋白质分离效率为70%[38]。
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学位论文 绪论 邵明栓等（2010）比较了两种絮凝剂对白鲢鱼糜漂洗液中水溶性蛋白质的絮凝效果。研究显示，褐藻胶的絮凝效果较氯化铁的要优。进一步研究表明，通过向250 mL漂洗液中添加1.0%的褐藻胶10 mL，蛋白质回收率可达到72.18%[39]。
Lalov IG等（2000）做了利用壳聚糖回收酿酒废水蛋白质的研究。实验探讨了壳聚糖浓度、絮凝时间对蛋白质回收率的影响。得到结论：利用壳聚糖回收COD为2800 mg O2/L的废水中蛋白质的最佳条件是，壳聚糖浓度为10 g/L，絮凝时间为30 min[40]。
L. J. Xu等（2001）在回收蛋清中蛋白质时，研究了木素硫酸盐、氯化铁等絮凝剂对蛋白质的絮凝效果。试验表明这些絮凝剂均能很好的回收蛋白质，降低溶液的COD值[41]。
P. Kaewkannetra等（2009）研究了Al2(SO4)3 对乳清悬浊液稳定性的影响。研究显示，添加Al2(SO4)3 能显著性的影响乳清悬浊液的稳定性。
1.4 膜分离技术概述 1.4.1 膜分离技术简介
1784年，Abbe N 观察到水会自发的穿过猪膀胱进入到酒精中。1864年，Traube 制造出了第一张人造膜——亚铁氰化铜膜，从此开始了人造膜的时代。上世纪60年代，膜技术得到了快速的发展和应用。其中，美国学者Leob 和Sourirajan 制备的固有高脱盐率、高水通量的对称、实用醋酸纤维反渗透膜标志着膜技术进入了全新的时代。按照时间顺序，膜技术在工业上的应用顺序为：上世纪50的微滤和离子交换膜，60年代的反渗透膜，70年代的超滤膜，80年代的气体膜和纳滤膜，90年代的渗透汽化膜。我国的膜技术研究是从1958年开始的，当时的研究主要集中在离子交换膜方面。经过半个世纪的发展，目前这些合成膜技术的主要应用集中在以下4个方面：分离（微滤、超滤、纳滤、反渗透、电渗析、气体分离、渗透汽化、渗析等）；控制释放（治疗装置、药物释放装置）；膜反应器（酶和催化剂反应器、生物反应传感装置）；能量转换（电池隔膜、电解器隔膜）等。
1.4.2 膜分离的原理
膜分离技术是用半透膜作为选择障碍层、在膜的两侧存在一定量的能量差作为动力，允许某些组分透过而保留混合物中其他组分，各组分透过膜的迁移
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学位论文 绪论 率不同，从而达到分离目的的技术。是一种属于传质分离过程的单元操作。膜可以是固态或液态，所处理的流体可以是液体或气体，过程的推动力可以是压力差、浓度差或电位差。根据截留组分的不同，膜分离主要包括渗透、反渗透、超滤、透析、电渗析、液膜技术、气体渗透和渗透蒸发等方法。膜分离示意图见图1-6所示。
图1-6 膜分离示意图
1.4.3 膜污染的流体动力学研究
膜分离过程中，渗透通量会随分离的进行而降低。渗透通量会从刚开始的最高值迅速下降，最后保持在一个取决于物料浓度和膜表面物料流速的数值。膜分离过程中渗透通量的降低与浓差极化和膜污染有关。其中，膜污染主要包括物料沉积、膜孔堵塞、蛋白质吸附。要揭示膜污染的机理，首先要明白膜过程中粒子的受力情况，如图1-7所示。
粒子受力分两种情况：流体中粒子受力和沉积的粒子受力。流体中粒子只受流体动力的影响；而沉积粒子相互之间还存在粘合力和摩擦力。流体中粒子的受力具体为：粒子正向流动速度w(y) 随着粒子与膜的距离y的减小而变慢，粒子随之会受到跨膜流动牵引力Fy 、正向流动牵引力FD和跨膜流动阻力FL 。
因为雷诺系数低，所以跨膜流动牵引力可近似用公式1-1计算。
FF3xv F （1-1） Stokesy正向流动牵引力FD与膜附近流速有关。可近似用公式1-2来计算。
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学位论文 绪论
FD2.11FStokes6.33xw(x/2) （1-2）
跨膜流动阻力FL的计算公式如公式1-3所示。
w1.5x30.5 FL=0.761 （1-3）
这些公式表明，小颗粒粒子更容易在膜表面沉积。
图1-7 单一粒子受力情况
注：W（y）——流体流速、FD——正向流动牵引力、FF——正向流动阻力、
FA——跨膜流动牵引力、FL——跨膜流动阻力
1.4.4 利用膜技术回收蛋白研究进展
由于大豆乳清蛋白的生物学特性已逐渐被揭开，国内外的关注度也日益加深，而膜分离技术因其耗能低、工程中不引起物质的相变、分离效果好、操作简洁等优点，使这两者成为了研究的热点。国内外对微滤分离回收蛋白的研究有：
陈爱梅（2005）讨论了截留分子量、温度、pH、压力对微滤效果的影响。得出这样的结论：采用截留分子量10000的CAX膜，压力0.2 MPa，温度40-50℃，pH值7.5的微滤条件，蛋白质截留率可达到90%以上[42]。
邵弘（2007）通过正交实验确定了影响膜分离的压力、温度、溶液pH等技术参数，确定了最佳的膜分离工艺条件：PXC010C50微滤膜在30 psi，温度室温，溶液pH 9的工艺条件下，渗透通量为31.2 L/m2·h，蛋白质截留率可以达到78.46%[43]。
冯晓（2009）研究了不同的微滤膜的渗透通量、衰减系数、蛋白质截留率
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学位论文 绪论 随时间的变化情况。确定了最佳的工艺条件：截留分子量10000的再生纤维微滤膜，工作压力30 kPa、溶液pH 9、温度20℃下，蛋白质截留率为78.46%。并通过模型模拟，确定了基于曲线拟合和BP神经网络建立模型的可行性[44]。
陈婷等（2010）做了微滤膜分离回收乳清蛋白的研究。研究中她们比较了不同的微滤膜的性能，选择出了最佳的膜材料和运行参数。结果表明：选用PW2540型聚醚砜卷式微滤膜，工艺参数控制在35℃温度，压力0.5 MPa，微滤膜通透量较高，运行稳定[45]。
Ting B.等（2010）利用微滤法从蛋黄中分离卵黄高磷蛋白。他们研究了溶液pH、压力、浓度对膜渗透通量的影响。他们发现，低浓度的碱性溶液下，膜有较高的渗透通量[46]。
Ali F等（2010）研究了膜分离对大豆分离蛋白性质的影响。他们在实验中比较了溶液pH 6和pH 9条件下微滤和透析对蛋白质性质的影响。研究表明，溶液pH为6下，通过微滤得到的蛋白质的溶解性较pH 9的高25%[47]。
1.5 蛋白质脱盐方法的研究进展
很多蛋白质的分离都会用到盐析法或它们来源于高浓度盐环境物质，这些盐的存在制约着蛋白质的充分利用，所以蛋白质的脱盐研究一直是研究的热点之一。目前，蛋白质主要的脱盐方法有透析、超滤、层析、电渗析等。国内外在蛋白质脱盐方面的研究有：
武军等（2006）研究了大豆乳清蛋白水解液的脱盐方法。研究中以纳滤膜为脱盐介质，研究了纳滤过程中的压力、膜通透量等指标。实验发现，0.6 MPa为最适的操作压力，梯度脱盐可有效地降低水解液含盐量[48]。
杨逸隆等（2010）在研究蜗牛嗉囊液木聚糖酶脱盐技术时，比较了透析、超滤、蛋白质回收装置脱盐法、Sephadex G-50柱脱盐对蜗牛嗉囊液木聚糖酶的脱盐效率。研究结果表明，四种方法中，Sephadex G-50柱脱盐是最佳的脱盐方法[49]。
张宇昊等（2010）对花生短肽的脱盐方法进行了研究。他们在实验中比较了离子交换树脂法、大孔树脂法和阴阳离子混合床法对花生短肽的脱盐效率。在确定阴阳离子混合床法为最佳脱盐方法的同时，也确定了最佳的脱盐工艺参数：每小时水解液过柱速度为柱体积的五倍，阴阳离子树脂装柱量质量比例为3:2。脱盐率达到80%[50]。
Cheison等（2007）研究了大孔吸附树脂对乳清蛋白酶解液的脱盐功效。随着蛋白酶解液被大孔树脂吸附，无机盐得到了脱出。脱出效率为15.71%[51]。
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学位论文 绪论 Ting等（2010）在分离浓缩卵黄高磷蛋白的同时研究了超滤法对卵黄高磷蛋白的脱盐效率。在超滤体系为50℃，10-30 kDa 超滤膜的情况下，卵黄高磷蛋白得到了有效地脱盐[46]。
1.6 本论文的研究内容
本论文以生产大豆分离蛋白流出废液为实验原料，通过两种途径回收大豆乳清蛋白，降低排除液中蛋白质浓度；并对膜微滤大豆乳清蛋白的工艺条件进行了研究。在获得乳清蛋白的条件下，讨论了两种脱盐方式对乳清蛋白的脱盐效果，检测了乳清蛋白的功能特性。
本论文的研究内容主要包括以下几个方面：
（1）原料预处理及主要成分检测 研究一种除大豆乳清中杂质，稳定实验材料的方法；并检测与实验相关的成分，即蛋白质、无机盐的含量。
（2）乳清蛋白的絮凝-离心分离 根据絮凝剂对大豆乳清蛋白的絮凝效果，选出了能高效絮凝大豆乳清蛋白的絮凝剂，同时确定最佳的絮凝条件。
（3）乳清蛋白的絮凝-微滤分离 根据絮凝剂促进乳清蛋白凝聚的效果，选择能高效提高大豆乳清蛋白粒度的絮凝剂；根据粒度结果选择合适的微滤膜，并以透过液中蛋白质浓度和膜渗透通量为指标，确定合适的微滤工艺参数。
（4）乳清蛋白的功能特性检测及脱盐试验研究。确定絮凝-微滤法制得的乳清蛋白产品的溶解性、热稳定性、含盐量。研究脱盐方法，确定乳清蛋白的最佳脱盐方法，以及脱盐效果。
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学位论文 绪论 - 12 -
学位论文 材料与方法
第2章 材料与方法
2.1 实验材料 2.1.1 主要试剂
实验中所用的主要试剂如表2-1所示。
表2-1 实验中的主要试剂
名称
絮凝剂LT 絮凝剂LX 絮凝剂LSX 絮凝剂LT’ 絮凝剂LG 絮凝剂LST 絮凝剂LSA 絮凝剂LM 絮凝剂LL 氢氧化钠 盐酸 硫酸 磷酸
牛血清白蛋白 硼酸 甲基红 溴甲酚绿 硝酸
规格 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯
产地
天津博迪化工股份有限公司 天津基准化学试剂有限公司 北京益利精细化学品有限公司 天津市科密欧化学试剂有限公司 天津市科密欧化学试剂有限公司 天津博迪化工有限公司 天津博迪化工有限公司 天津市光复精细化工研究所 天津市科密欧化学试剂有限公司 北京益利精细化学品有限公司 北京益利精细化学试剂有限公司 天津市科密欧化学试剂有限公司 天津市科密欧化学试剂有限公司 Sigma 公司
天津市科密欧化学试剂有限公司 天津市科密欧化学试剂有限公司 天津市博迪化工有限公司 天津市博迪化工有限公司
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学位论文 材料与方法 絮凝剂KJT 絮凝剂HZSN
生化试剂 分析纯
国药集团化学试剂有限公司 天津基准化学试剂有限公司
续表2-1
尿素 丙磺酸 二硫苏糖醇 Tris SDS 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 过硫酸铵 TEMED
考马斯亮蓝G-250 考马斯亮蓝R-250 无水乙醇 溴酚蓝 无水硫酸铜
生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 分析纯
美国Bio-Rad公司 美国Bio-Rad公司 美国Bio-Rad公司 美国Bio-Rad公司 美国Bio-Rad公司 美国Bio-Rad公司 美国Bio-Rad公司 美国Bio-Rad公司 美国Bio-Rad公司 美国Bio-Rad公司 美国Bio-Rad公司 天津津宇化工厂 Sigma 公司
天津市博迪化工有限公司
2.1.2 主要仪器设备
实验所用的主要仪器设备如表2-2所示。
表2-2 实验所用的主要仪器
实验仪器
离心机 分光光度计 层析试验柜 透析袋 凝胶成像仪
TGL-16LG UV-5100 YC-1
透析分子量3500 UNIVERSAL HOOD Ⅱ
型号
生产厂家
湖南星科科学仪器有限公司 上海元析仪器有限公司 北京博医康实验仪器有限公司 美国Spectra公司 美国BIO-PAD公司
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学位论文 材料与方法 切向流超滤系统，磁力搅拌式超滤杯
MILLIPORE LabscaleTM TFF System
续表2-2
美国密理博公司
真空冷冻干燥机 喷雾干燥设备 离心机 电泳仪
电热恒温鼓风干燥箱 电热恒温水浴锅 中试陶瓷膜设备 多孔复合陶瓷膜 酸度计
粒度分析与电位仪 超纯水纯化系统 分析天平 电子天平 旋涡混合器
数显恒温磁力搅拌器 电磁炉 马弗炉
等离子发射光谱仪 DSC
ALPHA 1-4 LSC EYELA SPRAY DRYER GL-10LM
MINI PROTEAN 3 CELL DHG-9245A DK-S26
孔径200nm PB-10 PALS/90P
MILLIQ-A MILLIPORE BS124S ALC-210 QT-1 HJ-3 LUBY SX 5300DV Pyris 6 DSC
德国 MARTIN CHRIST公司 日本 EYELA仪器有限公司 湖南星科科学仪器有限公司 美国BIO-PAD公司 上海一恒科技有限公司 上海精密实验设备有限公司 北京陶普森技术有限公司 北京陶普森技术有限公司 北京赛多利斯仪器系统有限公司 美国布鲁克海文仪器公司 密理博中国有限公司
北京赛多利斯仪器系统有限公司 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海琪特分析仪器有限公司 常州国华仪器有限公司 东莞电磁炉有限公司 春蕾集团 美国PE公司 美国PE公司
2.1.3 实验原料
大豆乳清来自黑龙江省哈高科大豆食品有限责任公司，原料取回到实验室置于4℃低温储藏。
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学位论文 材料与方法 2.2 实验方法
2.2.1 蛋白质浓度的测定
2.2.1.1 可溶性蛋白质采用考马斯亮蓝法
本部分参考Bradford[52]研究的方法，具体步骤如下： （1）溶液配制
① BSA标准溶液的配制 准确称取20mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为200 μg/mL的标准BSA溶液。
② 考马斯亮蓝G-250的配制 称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
（2）标准曲线的测定
0~200 μg/mL标准曲线的制作：取7支10mL干净的试管，按表2-3取样。然后将各试管漩涡混合20s，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的吸光度值A595nm，并以吸光度为横坐标，蛋白含量为纵坐标做标准曲线。
表2-3 考马斯亮蓝标准曲线制作方法
管号
200 μg／mL标准蛋白液（mL）
蒸馏水（mL）
考马斯亮蓝G-250试剂（mL）
1 0 1 5
2 0.1 0.9 5
3 0.2 0.8 5
4 0.4 0.6 5
5 0.6 0.4 5
6 0.8 0.2 5
7 1 0 5
（3）样品蛋白质的测定
根据样品中蛋白质浓度粗测值向试管中吸取相应体积的样品，不足1mL时用水填充至1mL，然后加入5mL考马斯亮蓝试剂，漩涡混合20s，放置2min后，在595nm波长下比色，记录吸光度，将测得A595值带入标准曲线求出相应蛋白浓度。
2.2.1.2 凯氏定氮法（GB/T5009.5—1985）
（1）样品处理 精密吸取5 ml液体样品，移入干燥的500 ml定氮瓶中，加入0.2 g硫酸铜，3 g硫酸钾及20 ml硫酸，放在消化器上消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5 h。取下放冷，小心加20 ml水。放冷后，移入100 ml容量瓶中，并用少量水清洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，
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学位论文 材料与方法 混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。
（2）蒸馏 向接收瓶内加入10 ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10 ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10 ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10 ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏5 min。移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1 min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。同时吸取10 ml试剂空白消化液做空白试验。
取下接收瓶，以0.05N硫酸标准溶液滴定至淡粉色为终点。记录消耗的酸液体积。
（3）计算 粗蛋白计算公式见式2-1。 X(V1V2)N0.0140 F100 （2-1）
V10100式中：X——样品中蛋白质的含量，g/100g；
V1——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，mL； V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，mL； N——硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014——1N硫酸或盐酸标准溶液1mL相当于氮克数； V——样品的体积，mL； F——氮换算为蛋白质的系数。
2.2.2 灰分含量的测定
参考国家标准（GB/T5009.4-85），取4个瓷坩埚置于马弗炉中，在550℃下灼烧0.5 h，冷至200℃以下后，取出，放入干燥器中冷至室温，精密称量，并重复灼烧直至恒重，并记录每个坩埚的重量；向其中三个加入2 g样品后，精密称量。样品小火加热至无烟后置于马弗炉中，在550℃灼烧至无炭粒，然后冷至200℃，取出测量每个坩埚质量。再次进行550℃灼烧半小时，然后冷却、取出放入干燥器中冷却至室温，称量。重复灼烧至前后两次称量相差不超过0.5 mg为恒重，灰分含量按公式2-2进行计算： Xm2m3100% （2-2）
m1m3- 17 -
学位论文 材料与方法 式中：X——样品中灰分的含量，%； m1——坩埚和样品中的质量，g； m2——坩埚和灰分的质量，g； m3——坩埚的质量，g。
2.2.3 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
采用Laemmli UK 的方法[53]进行蛋白质电泳分析实验。
2.2.4 大豆乳清蛋白的粒度测定
上世纪60年代起，光散射的理论和一起研究得到迅速发展，使得光散射测定的应用范围更加扩展。它的应用主要集中在胶体和高分子等微细颗粒物的观测，测定平均分子量和平均粒度分布。
研究微滤中微细粒物与微滤膜浓差极化形成关系的实验的方法。将样品放入样品池中进行测定。动态光散射测量角度为90°。每个样品的测定时间为3min。每个样品测定3次。选用MSD法按照颗粒的散射光强度分析数据，得出粒度分布图[54-56]。
2.2.5 膜实验
本部分实验包括膜的选择、动力学测定方法、膜工作参数的确定、膜的清洗。
（1）膜的选择 以粒度测定结果为标准选择孔径合适的陶瓷膜。 （2）动力学测定方法[54, 57, 58] 以膜渗透通量和蛋白质截留率作为膜实验的动力学测定方法。渗透通量计算公式如2-3所示。蛋白质截留率公式见公式2-4。
2 Jw(L/mh)V （2-3） A式中： Jw——渗透通量，L/m2·h
V——渗透液体积，L A——膜有效面积，m2 θ——运行时间 ，h
R(%)1
Cp （2-4） Cb- 18 -
学位论文 材料与方法 式中： Cp——透过液浓度
Cb——原料液浓度
（3）陶瓷膜组件的清洗
在每次过滤停机后或长期停机后必须对陶瓷膜装置进行清洗。具体清洗程序如下：
① 一次纯水清洗 清洗用水量与罐体积相同。循环清洗10-20分钟； ② 碱液清洗 清洗用的碱液采用1%的氢氧化钠和1%的次氯酸钠的混合液。清洗液温度为60℃。循环清洗30分钟；
③ 二次纯水清洗
④ 酸液清洗 清洗用酸液为1%的硝酸。清洗液温度控制在60℃。循环清洗30分钟；用去离子水漂洗至中性。
（4）初始水通量的测定：
新膜的纯水通量用WFR125表示，计算公式见公式2-5。
125(L/2m WFRQp——水流量，L/h
h)QpK/t(TMA P ) （2-5）
式中：TMP——操作压差，即进出口压力之和的一般，bar
Kt——温度校正系数，见附表1 A——膜有效面积，m2
（5）膜工作参数的确定 本部分研究连续工作时间与膜渗透通量、渗透液蛋白质含量之间的关系，以及料液温度对渗透通量、渗透液蛋白质浓度的影响。
① 连续工作时间的确定 确定合适的连续工作时间不仅影响到蛋白质的回收情况，还影响膜的寿命。连续工作时间太短，就会使得膜的利用率随之降低，蛋白质浓缩程度下降；连续工作时间太长，会加重膜的浓差极化，不利于膜的再生，影响膜的寿命。本部分实验，根据连续运行状态下，膜渗透通量、透过液蛋白质浓度为指标，选择合适的连续工作时间。
② 料液温度的确定 选定温度20-30、30-40、40-50℃下膜处理乳清，以膜渗透通量、透过液蛋白质浓度为指标，确定合适的料液温度。
2.2.6 大豆乳清蛋白性质的测定及脱盐方法的研究
2.2.6.1 蛋白质溶解性检测
溶解性的测定，参考Petruccelli[59]和Lin[60]实验中方法，并略加修改。样品溶液(1.43 g/L)，经0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH 分别调节至pH 3、5、7、9、11，在室温过夜保存。在12,000×g离心20min后留取上清液。上清液蛋白
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学位论文 材料与方法 质含量采用考马斯亮蓝法计算。蛋白质溶解度公式如2-6所示。
溶解度(%)上清液蛋白质含量100 % （2-6）
总蛋白质含量2.2.6.2 蛋白质热特性检测
用铝制坩埚(PE0219-0062)称取1mg(干基)大豆乳清蛋白，按质量比1∶2的比例加入去离子水，压盖密封后，置于室温隔夜平衡后测定。进行测定，空坩埚为参比，扫描温度范围为20~160℃，扫描速率为10℃/min。选取温度为30~160℃，计算热特征参数及热焓(ΔH)值。每个样品取2个平行样，结果取平均值[61]。
2.2.6.3 蛋白质含盐量检测
蛋白干粉中含盐量测定方法同2.2.2 灰分含量的测定（GB 5009.4-85）相同。 2.2.6.4 透析法脱盐
用去离子水对蛋白质进行脱盐试验。将200 mL 的蛋白液置于截留分子量为3500的透析袋中。然后将透析袋放在去离子水中，持续8 h，每隔1 h更换一次去离子水[48]。 2.2.6.5 超滤脱盐
采用MILLIPORE公司的脱盐超滤膜（截留分子量为10 KD）。将200 mL蛋白液置于超滤杯中，并向其中再添加300 mL去离子水。然后于入口压力30 Psi，循环口压力10 Psi条件下进行脱盐试验。溶液每浓缩至200 mL时，向罐内加入300 mL去离子水，相同操作循环脱盐8 h[46]。 2.2.6.6 灰分组分分析
参考叶锦润（2002）[62]的方法，使用美国PE公司的等离子发射光谱仪测定样品溶液中的元素含量。
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学位论文 大豆乳清的预处理研究
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学位论文 大豆乳清的预处理研究 第3章 大豆乳清的预处理研究
3.1 引言
由于原料大豆乳清直接来源于工厂生产大豆分离蛋白过程的废液，使得原料中存在着不稳定的成分（包括未沉淀完全的大豆球蛋白、少量的脂肪和其它微粒等）。为了试验原料的稳定，故需对原料进行适当的预处理。前人对大豆乳清预处理的研究主要采用离心法，但是研究中采用的离心条件各不相同。如刘国庆[63]等人选用2000 r/min，5 min；吴海波[64]在研究中选用4000 r/min，5 min；而刘鹤楠采用6000×g，15 min为离心条件对大豆乳清进行预处理。
本章在选用离心法除去乳清中的不稳定成分的同时，以蛋白质去除率为指标对离心条件进行了研究，并对处理后样品中与后期实验相关的主要物质的含量进行了相应的检测，为后期的研究奠定基础。
3.2 大豆乳清预处理条件的研究
实验中采用考马斯亮蓝法测定乳清中蛋白质含量。首先绘制标准曲线，曲线如图3-1所示。
图3-1 蛋白质标准曲线
计算机处理得回归方程： y = 4.807x + 0.02677 R2=0.9982
由回归方程和图3-1所示，蛋白质浓度和吸光度值具有良好的线性关系。
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学位论文 大豆乳清的预处理研究 经检测乳清中蛋白质含量为1.539±0.093 g/L。
将大豆乳清分别在3000、4000、5000、6000×g条件下离心5、10、15min。取上清液，测其蛋白质含量。通过计算各离心条件的蛋白质去除率确定最佳预处理条件。不同离心条件对蛋白质去除率情况见图3-2。
图3-2 不同离心条件对蛋白质去除率的影响
结果显示，随着离心力的增大，离心时间增长，大豆乳清蛋白质去除率随之增大。3000、4000、5000×g离心10、15 min与6000×g离心5 min的蛋白质去除率差异性不显著。此条件下可溶性蛋白质的去除率约为5%，溶液的稳定性肯定得到了很好的改善。且参考大豆分离蛋白生产工艺的离心条件——3000×g，15 min[65]，同时为了减少乳清蛋白的浪费和节约能源，所以选择3000×g，15min作为预处理大豆乳清的离心条件。
3.3 预处理后主要物质含量的测定 3.3.1 总蛋白质含量的测定
经预处理的大豆乳清总蛋白质含量为1.431±0.090 g/L，可以看出大豆乳清中蛋白质含量略有不同。不同批次的大豆乳清中蛋白含量有差异，原因可能是生产大豆分离蛋白时有少量未沉淀完全的分离蛋白依然存在于乳清中，加之生产工艺的波动性，不同生产批次混入的大豆分离蛋白量也会不同。这些客观因素的存在会使检测值出现一定的误差。
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学位论文 大豆乳清的预处理研究 3.3.2 灰分的测定
预处理后的大豆乳清中灰分含量测定结果如表3-1所示。
表3-1 大豆乳清灰分含量 （w/w）
样品 1 2 3 平均值 灰化前试样质量(g) 10.010 10.014 10.009 10.011 灰化后试样质量(g) 0.040 0.041 0.039 0.040 灰分含量(%) 0.403 0.405 0.392 0.400±0.007
3.4 本章小结
（1）对去除乳清中的不稳定成分的离心条件的研究结果为：能除杂但又不造成乳清蛋白大量损失的离心条件为3000×g，15min。
（2）处理后样品中蛋白质含量为1.431±0.090 g/L，灰分含量为4.00±0.07 g/L。
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究
第4章 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究
4.1 引言
大豆乳清是生产大豆分离蛋白过程中所产生的副产物。该废水中含有0.25%-0.5%的乳清蛋白，以及低聚糖、异黄酮等有效成分。一般厂家都将废水直接排除，排出的废水虽然无毒，但会造成水体微生物大量的繁殖，日久则腐败发臭影响人们的生活。国内外对大豆乳清蛋白的研究多集中在利用膜技术对大豆乳清蛋白进行浓缩分离，利用絮凝-离心分离法分离乳清蛋白的研究较少、且絮凝剂较为单一[64]。
本章通过选择合适的絮凝剂，使乳清胶体体系在絮凝剂的作用下，最大程度上相互接触、碰撞而脱稳、凝集成大粒径的凝集体，脱稳的凝集体进一步接触、碰撞、黏合、共沉淀等而聚集形成絮状体，即矾花。最终通过离心作用，沉降乳清蛋白，以达到固液分离、减少排出物中蛋白质残留量的目的[67]。本部分参考Tse（2001）[68] 的研究结果，以絮凝剂对蛋白质的絮凝沉降率为检测絮凝剂絮凝能力的指标。
4.2 絮凝剂的选择
本研究选用絮凝盐和高分子类絮凝剂，它们已在工业废水处理中得到广泛应用。本实验利用它们的凝聚作用，沉降回收大豆乳清蛋白。在解决大豆乳清蛋白引发的污染问题的同时也回收了蛋白质，变废为宝。为了筛选出有效的絮凝剂，设计了絮凝剂筛选试验如下。
按照表4-1分别向乳清中添加絮凝盐，使其在乳清中的浓度7.43 mmol/L，并调节乳清pH至3.5，然后与20℃下絮凝。
表4-1 絮凝剂Ⅰ筛选表
无机絮凝剂
LT LST LT’ LST’ LL LX LSX LM LSM LG
按表4-2所示，向乳清中分别添加相应量的高分子絮凝剂，并按照表中的参数控制絮凝过程。
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究
表4-2 絮凝剂Ⅱ筛选表
反应条件
絮凝剂
添加量 g/L
KJT HZSN KJT+HZSN DN
0.5 0.3 0.5+0.3 0.5
pH 4.5
温度 ℃
20
絮凝30min后，溶液经3000×g离心15min，留取上清液。采用考马斯亮蓝法测上清液蛋白质含量，然后绘制絮凝盐对乳清蛋白的去除能力图，如图4-1所示；以及高分子絮凝剂对乳清蛋白的去除能力对比图，如图4-2所示。
图4-1 絮凝盐对乳清蛋白的絮凝去除能力
注：图中字母相同表示差异不显著，不同表示差异显著（P<0.05）
通过图4-1和图4-2可以发现14种絮凝剂对大豆乳清蛋白絮凝能力差异显著，絮凝剂LT对乳清蛋白的絮凝能力最强，远远高于除絮凝剂LST之外的其他12种絮凝剂；四种高分子絮凝剂KTJ和HZSN的复合絮凝剂的蛋白质絮凝能力较它们的单一絮凝能力都有所提高。
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究
图4-2 高分子絮凝剂对乳清蛋白的絮凝去除能力
注：图中字母相同表示差异不显著，不同表示差异显著（P<0.05）
经不同絮凝剂处理后的上清液中蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳结果如图4-3所示。
参考Sorgentini（1999）[8]、陈爱梅（2006）[74]和帖向宇（2006）[77]的研究结果，乳清蛋白电泳条带从上往下依次是脂肪氧化酶、β-淀粉酶、血球凝集素、Kunitz抑制剂、细胞色素C和Bowman-Birk抑制剂。由图4-3可知，经絮凝剂LT和絮凝剂LST处理后的上清液电泳条带模糊；絮凝剂LT’和絮凝剂LST’处理过的上清液中脂肪氧化酶消失；絮凝剂LL处理液的脂肪氧化酶和β-淀粉酶均消失，血球凝集素、Kunitz抑制剂、细胞色素C和Bowman-Birk抑制剂含量也明显降低。这说明絮凝剂LT和絮凝剂LST对乳清蛋白组分的絮凝无选择性；絮凝剂LT’、絮凝剂LST’和絮凝剂LL的絮凝性具有选择性，三者相比较，絮凝剂LL的选择性更强。
综合图4-1、4-2和图4-3可以发现，絮凝剂LT是大豆乳清蛋白的一种高效絮凝剂；絮凝剂LL则对大豆乳清蛋白具有较强的选择絮凝沉降性。这两者能否混合使用，还需要我们对两者的复配絮凝剂对大豆乳清蛋白的絮凝效果进行研究，从而确定是否具有复配性。
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究
图4-3 不同絮凝剂处理后的上清液中蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳图 注：1-原样 2-LT 3-LST 4-LT’ 5-LST’ 6-LX 7-LSX 8-LM 9-LSM
10-LL 11-LG 12-KJT 13-HZSN 14-KJT+HZSN
为了明确絮凝剂LT 和絮凝剂LL 的复配絮凝剂对大豆乳清蛋白的絮凝效果，设计如下实验：
本部分依然选择乳清蛋白的沉降率作为絮凝剂凝聚能力的指标。按照表4-3
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究 中的参数，分别向样品中添加相应量的絮凝剂，并控制絮凝条件。
表4-3 复配絮凝剂凝集试验参数表
序号 1 2 3 4 5 6
絮凝剂 LT LL LT+LL LT+ LL LT+ LL LT+ LL
添加量 mmol/L
7.43 7.43 7.43+7.43 3.72+3.72 7.43+7.43 7.43+7.43
pH
3.5 3.5 3.5 3.5 4 5
温度 ℃
20
絮凝30min后，溶液经3000×g离心15min 离心，留取上清液。采用考马斯亮蓝法测上清液蛋白质含量，然后绘制絮凝剂对乳清蛋白的絮凝去除能力图，如图4-4。
由图4-4 可见，复配絮凝剂絮凝效果虽较絮凝剂的LL的有显著性提高，但其絮凝效果与絮凝剂LT的显著降低。这可能是由于两种絮凝剂对溶液pH条件要求不同，造成了絮凝过程中相互干扰。因此这两种絮凝剂对大豆乳清蛋白不具有复合絮凝性。
图4-4 絮凝剂对乳清蛋白的絮凝能力
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究 注：图中字母相同表示差异不显著，不同表示差异显著（P<0.05）
因此，本部分选出单一絮凝剂LT作为絮凝-离心法分离大豆乳清蛋白的絮凝剂。但是絮凝剂LT对乳清蛋白絮凝的最佳絮凝条件还需要我们进一步研究。
4.3 影响絮凝剂LT絮凝效果的单因素研究
参考Tse（2001）[68] 的研究表明，pH、温度和絮凝剂添加量对絮凝过程有较大影响。故本部分探讨pH、温度和添加量对絮凝剂LT絮凝效果的影响。
4.3.1 pH对絮凝效果的影响
因为pH不但影响蛋白质胶体体系的稳定性，还可以影响着絮凝剂LT的水解程度，其中在一般的酸性溶液中T3+是以八面体配位存在，碱性溶液中有一定程度的四面体配位。所以需要对其造成的影响进行研究，设计实验如下：
取大豆乳清，一组加入LT至2.0g/L，另一组不做处理。然后用NaOH和HCl分别调节pH至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，20℃下凝聚30min 后，3000×g离心15min。取上清液，采用考马斯亮蓝法测上清液蛋白质含量，然后绘制pH对絮凝效果的影响图4-5。
图4-5 pH对絮凝效果的影响
由图4-5可知，絮凝剂LT对大豆乳清蛋白的絮凝效果在pH 3.5前，随溶液体系pH的升高而增大。当pH达到3.5左右时出现其絮凝效果最佳。此后，
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究 蛋白质絮凝率随着体系pH的升高而降低，在pH 3.5-5阶段出现大幅下降。这种变化主要与T3+ 的水解作用有关。从图中还可以发现，pH在2.5-3.5范围内，絮凝率值较高且变化较小，可以认为是体系的最佳pH范围。
4.3.2 温度对絮凝效果的影响
取大豆乳清，一组加入絮凝剂LT至2.00g/L，调节pH至3.5；另一组不做任何处理。然后分别在10、20、30、40、50、60、70℃下絮凝30min后， 3000×g离心15min。取上清液，采用考马斯亮蓝法测上清液蛋白质含量，然后绘制温度对絮凝效果的影响图4-6。
从图4-6 中可以发现，随着温度的升高，絮凝率呈下降的趋势。实验中发现，温度小于20℃时，凝聚物分层清晰，上清液透明；而温度大于20℃，特别是大于30℃后，凝聚物部分上浮。这可能与T(OH)3的吸附作用有关。温度较高时造成蛋白质脱附，导致絮凝率下降。所以采用该方法时体系的宜选温度不应高于30℃。
图4-6 温度对絮凝效果的影响
4.3.3 添加量对絮凝效果的影响
取大豆乳清，分别加入絮凝剂LT至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L，调节pH至3.5，20℃下絮凝30min后，3000×g离心15min。取上清液，测其蛋白质含量。然后绘制添加量对絮凝效果的影响图4-7。
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究 由图4-7 可以看出，随着絮凝剂LT添加量的增加，絮凝率呈上升趋势，最后添加量为2.0 g/L时，絮凝率达到90%后趋于平缓且基本不变。这可从T(OH )3的吸附和吸附平衡方面解释。乳清蛋白絮凝率与絮凝剂LT添加量的呈现正相关，但会造成蛋白质中T含量增加，使得蛋白质颜色发生改变，进而给乳清蛋白质的开发利用带来不便。所以选择2.0 g/L作为絮凝大豆乳清蛋白质的絮凝剂LT添加量。
综合图4-5、4-6、4-7的实验结果可以得出，影响絮凝剂LT絮凝效果的单因素的适宜范围是：pH为2.5-3.5，温度不大于 30℃，添加量为2.00 g/L。由于这些因素混合在一起影响絮凝效果时不是单一性的，所以我们需要对这三个单因素条件进行正交分析，以确定最佳的絮凝条件。
图4-7 添加量对絮凝效果的影响
4.4 絮凝剂LT絮凝最佳工艺条件的确定
为获得絮凝的最佳工艺条件，在单因素试验的基础上，设计了一个三因素三水平的正交试验。其中因素水平表如表4-4 所示。
按照表4-4的设计，向乳清中添加相应量的絮凝剂LT，并严格控制其他两个条件。絮凝30min后，3000×g离心15min。取上清液，测其蛋白质含量。然后得到正交试验方案及结果见表4-5 和方差分析表见4-6。
由表4-5可以看出，利用絮凝剂LT絮凝大豆乳清蛋白絮凝工艺条件的最优水平为A3B2C3，即pH 3.0，絮凝剂LT添加量为2.50 g/L，体系温度为25℃。
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究 由表4-6可知，添加量和pH 对絮凝效果的影响显著，在这个温度区间，温度对絮凝效果影响较小。对比实验号2、8、9这三组的结果，也能反映这三个因素对絮凝效果的影响程度。
表4-4 正交试验因素水平表
水平
因素
A B C
LT添加量 (g/L) pH 温度 (℃)
1 2 3
1.5 2.0 2.5
2.5 3.0 3.5
20 25 30
表4-5 正交试验方案及结果
实验号
A 添加量 (g/L)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R
1 1 1 2 2 2 3 3 3 76.973 87.373 93.013 16.040
B pH 1 2 3 1 2 3 1 2 3 81.500 89.273 86.587 7.773
C 温度 (℃)
1 2 3 3 1 2 2 3 1 83.737 85.840 87.783 4.046
70.28 81.46 79.18 82.55 92.50 87.07 91.67 93.86 93.51
因素
蛋白质去除率（%）
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究 综合本章的研究结果可以得出：在体系pH 为3.0、温度为25℃、添加量为2.5 g/L时，蛋白质沉降率为93.86%。Fahim（2001）[69] 用LT处理鱼肉蛋白时沉降率为91.87%的结果接近。且LT起作用时的pH与乳清液的pH接近（约为4.5），故絮凝剂LT可以作为处理大豆乳清蛋白的絮凝剂进行使用。
表4-6 正交试验结果方差分析表
差异来源
A B C 误差
离差平方和 397.251 93.517 24.576 4.11
自由度 2 2 2 2
F值 96.561 22.731 5.974
临界值 F0.05(2,2)=19.0 F0.05(2,2)=19.0 F0.05(2,2)=19.0
显著性 * *
注：* 表示差异显著（P<0.05）
4.5 本章小结
（1）14种絮凝剂的絮凝能力的筛选结果表明：絮凝剂LT对大豆乳清蛋白具有高效絮凝特性；絮凝剂LL对乳清蛋白具有选择絮凝性，但絮凝效果不显著。絮凝剂LT-LL复合絮凝剂的絮凝能力相对于单一絮凝剂LT没有提高。因此，选择絮凝剂LT为大豆乳清蛋白絮凝-离心分离的絮凝剂；
（2）利用正交设计对絮凝剂LT絮凝-离心沉淀大豆乳清蛋白的絮凝条件进行了探讨，确定了最佳的絮凝工艺条件为：pH 3.0，絮凝剂LT添加量为2.5 g/L，体系温度为25℃，此时大豆乳清蛋白凝聚率为93.86%。
（3）由于絮凝剂LT絮凝乳清蛋白的pH条件与乳清液的pH接近，所以絮凝剂LT适合作大豆乳清蛋白絮凝-离心分离的絮凝剂
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-微滤研究 第5章 大豆乳清蛋白的絮凝-微滤研究
5.1 引言
膜分离是一种以滤膜为介质，借助压力实现物质分离的过程。它主要应用在粒径为0.02-10 μm的溶质分离中。因为该技术具有能耗低、分离过程中物质不发生相变、分离效果好、操作简便、无副作用、无二次污染、分离产物易于回收等优点，已被应用于污水处理和有机物回收中。但微滤过程中膜堵塞造成的膜渗透通量的降低，限制了膜技术的广泛应用。膜堵塞的主要原因是颗粒沉积在膜的内部和表面，形成了滤饼。也正是因为这个原因，造成了跨膜压力和流速不变的情况下，膜渗透通量随连续工作时间的增长而急剧下降。膜技术方面的研究也主要集中在解决渗透通量降低和膜堵塞问题。为了解决这两个膜技术的制约问题，大量学者进行了膜材料、料液、膜动力学方面的研究。研究表明，减轻膜堵塞的一种途径是控制流量，另一种是对料液进行预絮凝[55]。之前的研究表明，预絮凝能够降低膜通量的衰减速度[56]。Adin等人的研究发现，在絮凝有机物胶体时，与明矾相比，氯化铁的絮凝性更加显著[57]。Kaewkannetra等人的研究表明，硫酸铝添加量为5mg/L时，乳清蛋白粒径最大，蛋白质分离效果最好[58]。
本章节将先研究利用何种絮凝剂提高大豆乳清蛋白凝聚体粒度，进而对该乳清进行膜处理。本章以蛋白质凝聚体粒径大小、膜渗透通量、流出液蛋白质浓度作为指标，确定合适的絮凝剂，以及合理的膜工艺参数。
5.2 絮凝剂的选择
本部分依据絮凝剂絮凝蛋白质的原理，向乳清液中分别添加絮凝剂LT，絮凝剂LL，絮凝剂LG，絮凝剂LM，絮凝剂LX，絮凝剂LT`，絮凝剂LSA，絮凝剂KJT，絮凝剂HZSN，絮凝剂KJT+LT，絮凝剂KJT+HZSN，使它们在溶液中的浓度为0.02 g/L。充分搅匀后，采用光散射法测定凝聚体的粒度。结果如图5-1所示。
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-微滤研究
空白样——109nm 絮凝剂LT样——436nm
絮凝剂LL样——147nm 絮凝剂LG样——106nm
絮凝剂LM样——319nm 絮凝剂LX样——443nm
絮凝剂LSA样——65nm 絮凝剂LT`样——330nm
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-微滤研究
絮凝剂KJT样——425nm 絮凝剂HZSN样——136nm
絮凝剂KJT+LT样——434nm 絮凝剂KJT+HZSN样——333nm
图5-1 絮凝剂种类与凝聚体粒径关系
由图可知，絮凝剂LT、絮凝剂LX、絮凝剂KJT都能有效地提高大豆乳清蛋白凝聚体的粒度，粒度由之前的109 nm分别增大到436、443、425 nm；絮凝剂KJT和絮凝剂LT的复配絮凝剂与单一絮凝剂的粒度增大没有差别。此部分是膜技术应用前的一个预絮凝过程，考虑到絮凝剂KJT现在的售价和絮凝剂KJT凝聚体粒度形态多样性[70-71]对膜堵塞的影响，所以舍弃絮凝剂KJT。因此本小节选出絮凝剂LT和絮凝剂LX两种絮凝剂。
5.2 絮凝剂的絮凝条件研究 5.2.1 絮凝剂LT絮凝条件研究
鉴于絮凝剂LT的絮凝条件已经在第3章内容里做了研究，本小节仅研究添加量对预絮凝的影响。
絮凝剂LT添加量较大时会造成乳清蛋白的直接絮凝沉降，不利于膜过滤过程。为此，本小节研究了添加量为0.01 g/L和 0.02 g/L时溶液的凝聚物粒度大小。并将粒度结果与空白组粒度进行比较，确定合适的絮凝剂LT预絮凝添加量。
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-微滤研究 实验结果如图5-2所示。
添加量——0.02 g/L 添加量——0.01 g/L
空白对照
图5-2 LT添加量与凝聚体粒径关系
由图5-2和实验中蛋白质沉降情况知，随絮凝剂LT添加量的增加，凝聚体粒度显著性增大。当添加量为0.02 g/L时凝聚体粒子大小为436 nm，是原粒度的4倍；添加量为0.01 g/L时凝聚体粒度为149 nm。考虑到溶液中离子强度对膜分离的副作用[72]，因此选择絮凝剂LT添加量为0.02 g/L 。
5.2.2 絮凝剂LX预絮凝条件研究
吴彦瑜（2008）[73]的研究表明，絮凝剂LX 起作用的絮凝pH环境为碱性时更佳，而大豆乳清液的pH为4.8。为了确定絮凝剂LX是否具有可应用性，所以本小节先研究较大添加量的絮凝剂LX与蛋白质絮凝的关系，为絮凝剂LX的预絮凝条件的研究提供依据。
取大豆乳清，一组加入LX至5.5 g/L，另一组不做处理。然后用NaOH和HCl分别调节pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，20℃下凝聚30 min 后，3000×g
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-微滤研究 离心15min。取上清液，采用考马斯亮蓝法测上清液蛋白质含量，然后绘制pH对絮凝效果的影响图，如图5-3所示。
从图中可以看出，絮凝剂LX 起作用的最佳絮凝pH环境为7-8，如若利用其进行乳清的预絮凝，则需调节溶液的pH。而这样即增加了分离乳清蛋白的成本，又增大了溶液的离子浓度，加重了后续微滤过程的浓差极化，增大膜污染。所以，絮凝剂LX不宜作为预絮凝乳清溶液的絮凝剂。
图5-3 pH对絮凝效果的影响
综合上面的研究结果可得到，在添加量为0.02 g/L时，絮凝剂LT可作为大豆乳清蛋白膜分离前的絮凝剂。它对乳清蛋白的絮凝是否适合后续的膜分离，还需在下一步实验中研究。
5.3 截留浓缩大豆乳清蛋白的微滤实验研究 5.3.1 微滤膜的选择
根据絮凝剂LT絮凝后粒径结果，大豆乳清蛋白凝聚体的粒径在436 nm附近，本试验选择孔径为200 nm的陶瓷膜来截留、浓缩大豆乳清蛋白。其中所选陶瓷膜的性能指标如表5-1所示。
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-微滤研究
表5-1 陶瓷膜的性能指标
性能 支撑体结构 膜材料 膜孔径 工作温度
指标 多空复合陶瓷芯
氧化钴、三氧化二铝、二氧化钛
200 nm < 350 ℃
性能 pH范围 最大工作压力
管长 单只膜面积
指标 0-14 < 0.55 MPa
1 m 0.1 m2
5.3.2 新膜初始水通量的测定
经循环清洗的膜的初始水通量是：
WFR125=697.5±3.5 L/(h·m2) （5-1）
5.3.3 料液温度、连续工作时间对渗透通量和透过液蛋白质浓度的影响
0.2 MPa下，对三个不同温度区间的大豆乳清进行微滤时的膜渗透通量随时间变化曲线，如图5-4所示。
图5-4 渗透通量随时间变化曲线
透过液中蛋白质浓度随时间变化曲线，如图5-5所示。
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-微滤研究
图5-5 透过液蛋白质浓度随时间的变化曲线
由图5-4和图5-5可以看出，温度对膜渗透通量的影响较大，渗透通量随温度升高而增大，随运行时间增大而降低；透过液蛋白质浓度随时间的延长而增大。
渗透通量随温度升高而增大有两个原因：一是温度升高，料液黏度降低，有利于渗透；而是温度升高膜本身溶胀。而透过液蛋白质浓度出现图5-5所示结果，也主要是受温度的影响。温度升高膜面蛋白质浓度增加，影响蛋白质的截留率。考虑到大豆乳清液排出时温度在40-50℃范围，为达到快速节流蛋白质，减轻膜污染又尽量降低透过液蛋白质浓度的目的，可用絮凝剂LT预絮凝的工厂排除液，然后进行乳清蛋白的浓缩分离，70 min内可保持较高的膜渗透通量，此时的膜渗透通量为319.83 L/(m2·h)，透过液蛋白质浓度为6.21 mg/L。刘鹤楠（2008）[66]采用离心和0.45μm微滤相结合的方法，得到的乳清液中蛋白质含量为0.528 g/L。吴海波（2009）[64]在对大豆乳清处理时采用CaCl2絮凝和0.22μm微滤相结合的方法，虽然有效去除了杂质，但蛋白质也损失了10.2%，而且还使乳清pH由原来的酸性变为7.5。相比较而言，采用絮凝剂LT处理的乳清在微滤中透过液蛋白质浓度较低，故此方法是可行、有效的。
5.4 本章小结
（1）通过预絮凝剂的筛选结果知絮凝剂LT、絮凝剂LX和絮凝剂KJT均能有效地增大乳清蛋白的粒度。但絮凝剂LX发挥絮凝作用的pH与原料乳清的
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学位论文 大豆乳清蛋白的絮凝-微滤研究 初始pH太多，而絮凝剂KJT形成的絮凝体形态上不利于膜分离过程。因此选择絮凝剂LT为大豆乳清蛋白的预絮凝剂。最适添加量为0.02 g/L，此时大豆乳清蛋白凝聚体的粒径为436 nm左右；
（2）采用孔径为200nm的陶瓷膜对预絮凝的大豆乳清蛋白的微滤实验知，可以直接对预絮凝后的工厂排放液进行微滤，70 min内膜可保持较高的膜渗透通量，较低的透过液蛋白质浓度的状态。此时的膜渗透通量为319.83 L/(m2·h)，透过液蛋白质浓度为6.21 mg/L。达到了快速截留蛋白质，减轻膜污染，降低透过液蛋白质含量的目的。
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学位论文 大豆乳清蛋白的性质测定及脱盐方法研究 第6章 大豆乳清蛋白的性质测定及脱盐方法
研究
6.1 引言
本章测定了第5章浓缩的乳清蛋白液在进口温度160℃、喷雾压力1.8×105 Pa、进料速度600 mL/h条件下喷雾干燥后蛋白质的溶解性、热稳定性、灰分含量。通过对比两种脱盐方式——透析和超滤的脱盐效果，选择最佳的脱盐方法，对大豆乳清蛋白的进行脱盐。然后通过分析脱盐后样品溶液中的元素的含量，验证、推测蛋白质与絮凝剂结合机理。
6.2 大豆乳清蛋白的溶解度
按照实验设计的方法，研究的pH与大豆乳清蛋白溶解度的关系，如图6-1所示。
图6-1 不同pH下大豆乳清蛋白的溶解性
由图6-1可以看出，大豆乳清蛋白的蛋白溶解性随pH降低而增加，在pH 3-5范围内乳清蛋白溶解度为8.6%。
本试验中蛋白质的溶解度较前人的研究结果较低。在pH 3-5范围内，刘鹤楠（2008）的实验结果为94%以上；陈爱梅（2006）[74]的实验表明，大豆乳清蛋白在pH 2-10范围内有良好的溶解性，均超过80%。分析溶解性差异性产生
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学位论文 大豆乳清蛋白的性质测定及脱盐方法研究 的原因，这可能是絮凝剂与蛋白质产生了结合，而这种结合力受pH的影响较小，使得乳清蛋白凝聚物无法分解，蛋白质无法溶解。
6.3 大豆乳清蛋白的热稳定性
经测定，大豆乳清蛋白的热稳定性测定结果如图6-2所示。
图6-2大豆乳清蛋白的热变性曲线
由图6-2可知，乳清蛋白从78.29℃开始相变，在84.75℃出现峰值，相变焓为2.4036 J/g，峰面积为21.873 mJ。
DSC图谱中，蛋白质的热变性峰值温度表征蛋白质的热稳定性，峰值温度越高，稳定性越好；峰面积与蛋白质的结构有序程度有关，蛋白质凝集和疏水作用与放热焓多少有关[75]。图6-2显示，经过LT预絮凝的乳清蛋白在84.75℃出现了一个相变峰，这与郑志雄（2008）[76]研究未经处理的大豆乳清蛋白热变性温度为70.6℃的结果有差异，乳清蛋白热稳定性提高。大豆乳清蛋白的热变性温度与组分中的脂肪氧化酶有关。因为脂肪氧化酶是一种非血红素铁蛋白，铁离子位于酶分子的内部，而其他部分组分均为含有二硫键或者巯基的分子。热处理时，脂肪氧化酶的四级结构会发生变化，酶失活的同时蛋白质的疏水性增加。这些因素可能诱使加热过程中大豆乳清蛋白各组分间的交联，形成较大的蛋白凝聚物，使得变性温度增大[77]。综合这些研究结果，可推测造成热变性温度差异的原因是预絮凝过程中添加LT，提高了蛋白凝聚体粒度造成的。
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学位论文 大豆乳清蛋白的性质测定及脱盐方法研究 6.3 大豆乳清蛋白的灰分含量
对大豆乳清蛋白灰分含量的测定结果如表6-1所示。
表6-1 乳清蛋白灰分含量（w/w）
样品 1 2 3 平均值 灰化前试样质量(g) 0.4078 0.4032 0.4058 0.4056 灰化后试样质量(g) 0.3532 0.3458 0.3476 0.3489 灰分含量(%) 86.61 85.76 85.66 86.01±0.52%
由表6-1可知，大豆乳清蛋白中的灰分含量较高，含量为86.01±0.52%。如此高的灰分含量也可能是乳清蛋白溶解性偏差的其中一个原因。
6.4 大豆乳清蛋白的脱盐方法研究
考虑到在实施脱盐时，其他脱盐方法需要将乳清蛋白充分溶解且需使其一直保持溶解状态。故本小节以溶液的电导率的变化和溶液中蛋白质浓度为指标，研究了相同时间——8 h，透析和超滤两种方法的脱盐效果。两种方法的指标对比如表6-2所示。
表6-2 乳清蛋白脱盐方法对比
方法 透析 超滤
电导率（ms/cm）
1.092 3.675
检测指标
蛋白质浓度（g/L）
0.794 0.789
注：原蛋白乳清溶液的电导率为63.465 ms/cm
从表6-2可以看出，相同的时间内，两种方法均能够有效地降低溶液的电导率。但相比较而言，透析法处理的乳清溶液的电导率更低，同时溶液中蛋白质的含量更高。
为了更好的了解透析法处理效果，本小节又做了处理液中元素含量的分析实验。根据试验方法中元素测定的方法，测定的透析法处理后溶液中的元素含量变化表，如表6-3所示。
从表6-3可以看出，乳清蛋白经过透析法脱盐，主要元素脱出效果明显。
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学位论文 大豆乳清蛋白的性质测定及脱盐方法研究 由表6-2、6-3知，乳清蛋白较好的脱盐方式为透析脱盐，它有效地去除了溶液中的无机盐。
表6-3溶液中主要元素含量（mg/L）
元素
试样
K
原液 透析液
4.621 0.09463
Mg 0.9553 0.06326
Mn 0.01517 0.00145
6.5 本章小结
（1）采用絮凝-微滤法得到的乳清蛋白液在进口温度160℃、喷雾压力1.8×105 Pa、进料速度600 mL/h条件下喷雾干燥后蛋白质的溶解性在pH 3-5范围内，溶解度最大，为8.6%。
（2）乳清蛋白热稳定性提高，从78.29℃开始相变，在84.75℃出现峰值，相变焓为2.4036 J/g，峰面积为21.873 mJ。
（3）大豆乳清蛋白中的灰分含量较高，含量为86.01±0.52%。 （4）乳清蛋白较好的脱盐方式为透析脱盐。
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学位论文 结 论
本研究中采用离心法去除乳清中的不稳定成分确定离心条件是3000×g，15min。处理后样品中蛋白质含量为1.431±0.090 g/L，灰分含量为4.00±0.07 g/L。
14种絮凝剂对大豆乳清蛋白的沉降实验研究表明：絮凝剂LT可高效沉降乳清蛋白，它对蛋白质絮凝效率为90%；絮凝剂LL可以选择性沉降乳清蛋白，电泳结果表明，它能够选择性的沉降脂肪氧化酶和β-淀粉酶。复配絮凝剂LT-LL乳清蛋白的絮凝沉降效果的实验表明，复合絮凝剂对乳清蛋白的絮凝沉降率虽比单一絮凝剂LL的高，但与LT的相比显著降低。单一絮凝剂LT絮凝乳清蛋白的絮凝条件的单因素和正交试验研究表明，絮凝剂LT絮凝乳清蛋白的最佳絮凝条件为：体系pH 3.0，添加量为2.50 g/L，体系温度为25℃。经3000×g，15min离心后，蛋白质的去除率为：93.86%。
通过对11种预絮凝剂对蛋白凝聚体粒径的影响的结果进行对比，选出了絮凝剂LT和絮凝剂LX，它们均显著性的提高乳清中凝聚体的粒径。絮凝剂LX絮凝条件的研究表明，最佳的絮凝pH范围为7-8，大于大豆乳清溶液的pH 4.5。故絮凝剂LX不适宜作为大豆乳清蛋白的絮凝剂。对絮凝剂LT添加量与乳清蛋白凝聚体粒径增大程度的研究表明，絮凝剂LT最佳添加量为0.02 g/L，此时蛋白质凝聚体的粒度为436 nm。絮凝剂LT絮凝后的蛋白溶液的200 nm的陶瓷膜的微滤工艺参数的研究表明，体系温度为40-50℃，压力为0.2 MPa，70 min内可保持较高的膜渗透通量，此时的膜渗透通量为319.83 L/(m2·h)，透过液蛋白质浓度为6.21 mg/L。
对絮凝-微滤技术分离的乳清蛋白经喷雾干燥，其溶解度在pH 3较好，为8.6%。同时，其热稳定性测试结果表明，处理后蛋白质稳定性增强。此法分离的乳清蛋白在78.29℃开始相变，在84.75℃出现峰值，相变焓为2.4036 J/g，峰面积为21.873 mJ。其灰分含量为86.01±0.522%。透析和超滤两种脱盐方法对乳清蛋白的脱盐效果的研究表明，透析法脱盐后溶液电导率为1.092 ms/cm，是超滤法得到的溶液电导率的三分之一，且透析法得到的溶液的蛋白质浓度较高，故其为更佳的乳清蛋白脱盐方式。对样品溶液中的元素含量测定结果表明，透析法有效地去除了溶液中的无机盐。
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学位论文 致 谢
本文的工作是在导师张兰威教授的悉心指导下完成的，张老师严谨的治学态度和科学的工作方法给了我极大的帮助和影响。在此感谢张兰威老师对我的关心和指导。张老师渊博的知识、严谨的治学态度、豁达的待人方式以及孜孜以求的敬业精神时刻激励着我，使我终生受益。在此，谨向我敬爱的导师表示诚挚的敬意和衷心的感谢！
在课题的进程中还得到了许多老师和同学的帮助。感谢实验室的杜明、韩雪、易华西老师在仪器、器材购买和设备使用方面给予的大力支持。也感谢梁栋、冷佳、郭春锋、李婧妍、张英春、张丽莉、马春丽、王伟军、李延华、洛雪、王春梅、范荣波、李琦、薛超辉等师兄师姐们在我实验过程中提出的宝贵意见。同时还要感谢李宝磊、杨晓春、高海波、程金菊等同学以及刘猛、徐显睿、张文龙等师弟师妹们的帮助。
衷心感谢我的父母、亲人，是他们给了我无私的物质支持和精神支持，鼓励我在求学的道路上勇往直前，实现我的梦想。也感谢女友田杰在生活和学习上的支持和理解。
衷心感谢百年学府——哈尔滨工业大学！校风浸染，师恩永泽，我永远不会忘记在哈尔滨工业大学大学度过的每一个日夜，永远不会忘记陪伴我度过这段岁月的人们！即将毕业，在以后的日子里，我将真诚面对，奋勇向前，报答老师、学校、朋友们的恩情。
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