Ku基因在微生物中的研究进展

张小娟;文莹

【摘 要】ku基因介导的非同源末端连接（NHEJ）途径是DNA双链断裂（DSBs）的一种修复机制，它不依赖于同源重组，且通过与之竞争而削弱同源重组。由于地基因在生物进化过程中的高度保守性，其功能在很多微生物中已经得到研究，尤其在丝状真菌中，将Ku基因敲除，在NHEJ途径缺陷的背景下，同源重组发挥主要作用，基因敲除的频率大为提高，从而方便了对基因功能的研究。%Non-homologous end joining （NHEJ） mediated by ku genes is a repair type of DNA double-strand breaks （DSBs）. NHEJ pathway is independent of homologous recombination （HR）, and decreases HR with competitive relationship, ku genes are highly conservative in t 【期刊名称】《生物技术进展》 【年(卷),期】2011(001)001 【总页数】7页(P26-31,F0003)

【关键词】Ku基因;非同源末端连接（NHEJ）;同源重组频率 【作 者】张小娟;文莹

【作者单位】中国农业大学生物学院微生物学与免疫学系,北京100193;中国农业大学生物学院微生物学与免疫学系,北京100193 【正文语种】中 文 【中图分类】Q936

ku基因所编码的Ku蛋白最早是在一位患有多发性肌炎-硬皮病重叠综合症自身免疫疾病的日本姓Ku患者的血清内发现的[1],它是由Ku70和Ku80两个亚基紧密结合形成的异源二聚体,由于两个亚基的分子质量分别是70 kDa和83 kDa,因此得名Ku70和Ku80[2]。Ku蛋白广泛存在于人类、哺乳动物、线虫、酵母、原核生物以及植物中,具有多种重要的功能,参与了DNA双链断裂的修复、DNA复制、基因转录调控等许多重要的生物学过程。在酵母中,比较Ku70和Ku80两个亚基时发现,位于两个亚基C-端的氨基酸中22%是相同的,38%是相似的[3],表明它们很可能起源于同一个基因,二者都含有典型的介导蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用的区域。本文主要介绍ku基因在DNA双链断裂(DSBs)修复的非同源末端连接(NHEJ)途径中所发挥的重要作用以及在微生物中的研究进展。 1 DNA双链断裂修复

在生物中,来自外界的物理辐射、化学物质,以及自身具有氧化性质的新陈代谢副产物都会导致DNA双链断裂(double strand breaks, DSBs)。如果断裂未得到修复,则会造成细胞染色体的丢失甚至细胞的死亡;不正确的修复则会引起基因的突变和染色体的重排[4]。

对于DNA双链断裂,生物体内存在两种修复途径:同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)[5]。原核生物和真核生物的同源重组修复过程是比较相似的:断裂DNA末端侵入完好的同源染色体DNA双链,延伸实现DNA的复制,然后经过Holliday中间体断裂,出现多种不同类型的基因组重排[6]。非同源末端连接不涉及同源重组,通过断裂末端突出的单链之间错排配对,断裂DNA的两个末端直接相互连接,这种错排配对是通过小段(可以短至一个碱基对)互补碱基之间的匹配完成的(偶尔发现有微小的同源性)[7]。单链尾巴用核酸酶去除,缺口用DNA聚合酶填补。HR进行精

确的损伤修复,而NHEJ可引起不精确连接,且有赖于Ku蛋白的参与。 2 Ku蛋白与NHEJ途径

NHEJ在生物的整个进化过程中是至关重要的,且具有高度的保守性。在哺乳动物中,NHEJ途径研究得相对清楚。DNA双链断裂发生后,Ku70/Ku80二聚体首先结合到断裂的DNA末端,DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PKcs)与Ku蛋白形成复合物,加固与DNA末端的结合,形成末端间联会;同时,DNA-PKcs被激活,发生一系列的磷酸化。这样,在不破坏末端联会的情况下,DNA-PK-DNA末端复合体发生构象的变化,激活ARTEMIS的内切酶活性,然后在DNA聚合酶μ或者λ的作用下完成DNA缺口的修补,以及在DNA连接酶IV/XRCC4复合体作用下的连接(图1)[8]。Ku蛋白与这些片段的连接并不依赖特定的核苷酸序列或结构。

目前,Ku70/Ku80的晶体结构已经得到(图2,彩图见封三图版)[9]。两个断裂的DNA末端分别结合了一个Ku70/Ku80二聚体,两个二聚体进一步作用形成“桥”。研究发现,Ku蛋白不与DNA碱基结合,也很少与糖磷酸骨架结合。DNA双螺旋的大小沟被严格地限制在Ku二聚体形成的Ku环中。这就是Ku蛋白与DNA结合时不受DNA序列限制的原因[9]。

图1 NHEJ简单示意图[8]Fig.1 A simple model of NHEJ[8]. 图2 Ku-DNA复合物的结构图[9]Fig.2 Structure of the Ku-DNA

complex[9].A:Ku-DNA复合物; B:俯视图; C:侧视图。红色表示Ku70,桔色表示Ku80,浅灰色表示糖磷酸骨架,深灰色表示碱基。(彩图见封三图版). 3 HR和NHEJ之间的关系

生物体中的HR和NHEJ修复途径是两个相对独立的过程,目前认为可能存在一种竞争机制来分配这两种修复的频率。在曲霉属和脉孢菌属中的研究表明,将ku基因破坏,同源重组的频率得到提高[10～13]。但是,这也不是绝对的。Secretan等[14]设计了一个精巧的瞬间转染实验,监测Ku蛋白和DNA-PKcs的突变对HR和

NHEJ的影响。在中国仓鼠卵巢细胞系中,Ku蛋白的缺失使NHEJ的发生降低到正常细胞的50%,在DNA-PKcs的缺失中则达到了20%～30%,但是HR的效率几乎没有变化,表明HR和NHEJ修复是两个相对独立的过程。

然而,对于DSBs的修复,HR和NHEJ也不是两个完全平行的过程,在细胞循环的S期就会有交叉的部分。HR修复主要是在染色体的复制阶段存在姐妹染色体时[15],而NHEJ修复主要发生在细胞的非复制阶段(G1期)或是分裂末期(G0期)。在高等真核生物中,细胞的生长周期大部分都处于G0和G1期,所以它们的DSBs修复主要依赖于NHEJ修复。NHEJ的突变导致在整个细胞周期循环中对电离辐射敏感,但是在S后期具有一定的抗性,这表明在此期间存在另外一种机制。在酿酒酵母(Saccharomyces cereuisiae)的RAD54(在同源重组中起主要作用)/Ku70突变系中,RAD54-表现较Ku70-更为严重,同时RAD54-/Ku70-双突变较每一个单突变更严重[16,17],这表明在DNA双链断裂修复中,HR和NHEJ是共同作用的,其中HR起主要作用,NHEJ作为后盾力量,而当HR失活后,NHEJ增加修复能力,以保证细胞周期顺利完成。

不同生物体中,HR和NHEJ途径参与比例不同。在酵母中, DSBs的修复主要依靠HR。然而,在多细胞的真核生物中,NHEJ起主要作用。多细胞真核生物具有大量的DNA重复片段,例如,在人类的基因组中有40%的重复片段,若进行同源重组修复,同源片段的联会过程将会很混乱,从而减慢修复速度,错误率也比较多[18]。在哺乳动物中,NHEJ的发生频率是HR的100～1 000倍[19,20]。 4 ku基因在丝状真菌中的研究

由于ku基因在生物进化中的高度保守性,其基因功能在微生物中的研究也越来越受到关注。ku基因介导的NHEJ途径与HR途径存在竞争关系,将NHEJ途径破坏后,可增加同源重组的活性,从而方便后续的基因打靶和基因功能的研究。这方面的应用在丝状真菌中研究得比较深入。

Nayak等[10]在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中将ku70同源序列nkuA敲除后,基因打靶频率明显提高,同源片段长度为1 kb时打靶频率最高,且nkuA突变株对各种DNA损伤剂不敏感。Takahashi等[11]研究了ku基因在米曲霉(A.sojae)和酱油曲霉(A. oryzae)中的作用。将ku基因同源序列Aoku70、Aoku80基因破坏,突变株生长情况正常,对DNA损伤剂无明显敏感性[21]。但是ku基因突变株基因打靶频率大大增加,从1%提高到了70%,并且证明了在基因打靶过程中同源区域较长时打靶频率较高[11]。Meyer等人同样在黑曲霉(A. niger)中破坏了ku70的同源序列kusA,发现同源重组频率从原来很低的7%增加到了80%,同源序列越长,同源重组频率越高。kusA突变株对X射线和紫外线敏感性增加[12]。烟曲霉(A. fumigatus)的aku70敲除,同样增加了同源重组频率[22]。

Ninomiya等[13]将粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中的ku70和ku80的同源基因mus-51和mus-52敲除,发现突变株生长情况正常。与野生型菌株相比,对甲基磺酸甲酯、乙基磺酸甲酯和博来霉素敏感性提高,但对紫外线、喜树碱和羟基脲等物质敏感性差异较小。通过外源基因的打靶实验发现同源重组频率从原来的20%～30%增加到了100%,该突变株已被广泛应用于粗糙脉孢菌中基因功能的研究。Zhang等[23]敲除了瑞氏木霉(Hypocrea jecorina)的tku70基因,发现基因打靶频率从以前很低的5%～10%增加到了95%以上。ku基因的功能在麦角菌(Claviceps purpurea)[24]和稻瘟菌(Magnaporthe grisea)[25]中同样得到证实。 ku基因的缺失除了能增加同源重组的频率外,还可以缺失一段夹在两个同源区域之间的更长的非同源序列。之前的研究中,只是针对单个基因的缺失或者比较短的核苷酸序列。在丝状真菌中,同源重组频率很低,要想缺失大于200 kb的序列是几乎不可能的,即使采用滚环替代的方法也很难完成。Takahashi等[26]在酱油曲霉(A. oryzae)的NHEJ缺陷菌株中,成功地缺失了470 kb和200 kb的片段,说明NHEJ的缺陷可以增加替换型重组中非同源区域的长度。此方法的建立可以通过替换重组

来缺失大片段染色体,有利于真菌基因的功能研究,例如黄曲霉素生物合成基因簇。 以上结果表明,在丝状真菌中敲除ku基因后,基因打靶效率大大提高。这是因为在丝状真菌中,DSBs修复途径主要是NHEJ,这也是导致基因打靶效率极低的原因。将NHEJ途径破坏后,同源重组自然就发挥主要作用,提高了基因敲除的效率。与之相反,在酿酒酵母(S.cerevisiae)中,HR途径为主要修复途径,基因打靶频率非常高[27],仅仅40 bp的同源序列就可以介导同源重组[28]。而在其他真核生物中同源区域小于100 bp无法完成基因打靶,即使在NHEJ缺失菌株中也是一样[13,22,29]。 虽然说将丝状真菌中的ku基因敲除,确实极大地提高了同源重组频率,为大量的基因功能研究提供了便捷,但是由于ku基因缺失后的生物体缺少了一种DNA修复机制,往往会对一些DNA损伤因素敏感性增加,这对于工业生产是不利的。在工业菌株的改良过程中,菌株对DNA损伤剂的敏感性很重要,可能会影响到传统变异和特殊酶蛋白的表达。虽然一般认为ku基因的缺失不会影响大部分基因的生物技术应用,但是必须考虑到这些菌株缺少了重要的DNA修复机制,而且Ku复合物曾被报道影响细胞的基本特征,例如端粒的稳定性、细胞核空间结构或有丝分裂的再结合[30～33]。

5 ku基因在细菌中的研究

Aravind和Koonin[34]在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis),天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)的基因组中都发现了高度保守的Ku核心区域,并常和连接酶、引物酶一起组成DNA修复系统,预测它们也具有相似的功能(图3)。

Weller等[35]在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)中鉴定到了Ku蛋白的类似物,具有真核生物Ku异源二聚体的生化特性,它募集DNA连接酶到DNA末端并促进DNA的连接。将该蛋白破坏导致菌体对电离辐射的高敏感性。细菌的孢子由于其自身结构

特点,对外界的压力具有高度的抗性,Weller等推测原核生物Ku系统的NHEJ对在休眠期内产生的DSBs修复是在孢子萌发期进行的。Moeller等[36]对枯草芽孢杆菌(B. subtilis)的野生型和DNA修复突变株(recA、splB、ykoU、ykoV和ykoUykoV)的孢子抵抗紫外线、电离辐射和超高真空的NHEJ修复进行了研究。结果发现,NHEJ修复缺陷突变株(ykoU、ykoV和ykoUykoV)的孢子和野生型孢子相比较,对紫外线、电离辐射和超高真空处理更加敏感,说明在孢子萌发阶段NHEJ是DSBs修复的一个重要的途径。耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)的NHEJ修复系统由Ku蛋白和连接酶LigD组成,该修复是有效的,但是错误率很高,DSBs的平末端和5′端的NHEJ修复突变率达到50%。NHEJ对分支杆菌提供了逃避遗传毒性的生存机制,保证了染色体的完整性[37]。

图3 编码假设的双链断裂修复系统组分的预测启动子的基因结构[34]Fig.3 Gene organization in the predicted operons encoding components of the postulated novel double-strand-break repair system[34].

ku基因在许多长期侵染真核寄主生物的病原菌,如:根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、结核分支杆菌

(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和共生体(如根瘤菌属)中也有发现。Kobayashi等[38]在苜蓿中华根瘤菌

(Sinorhizobium meliloti)中发现了4个ku的同源基因,并且它们都有功能,其中sku2起主要作用。将SKu2蛋白与黄色荧光蛋白YFP融合,通过电离辐射诱导合成,发现SKu2蛋白聚集在DNA双链断裂处,并且随着电离辐射剂量的加大,聚集增多,表明NHEJ修复在共生体的长期侵染阶段也起作用。 6 讨论

基因打靶(gene targeting)技术已经成为目前研究基因功能最直接、最有效的方法之一,而同源重组频率决定了基因敲除的效率。在丝状真菌中的研究表明,将ku基

因破坏之后,基因敲除的效率大为提高,可以建立一个高效的基因打靶系统,方便对大量基因的功能进行研究。链霉菌虽为原核生物,但菌体形态与丝状真菌相似,基因打靶效率也较低。生物信息学研究表明,链霉菌中也具有ku同源基因,但功能尚未见报道。本实验室将阿维链霉菌中的ku同源序列ku1、ku2缺失,同源重组频率有所提高,但不如丝状真菌中的显著,可能是由于链霉菌中NHEJ途径所占比例没有丝状真菌中那么高(待发表)。

ku基因的功能在哺乳动物中研究得较为深入,它不仅参与DSBs修复,还参与DNA复制及基因表达的调控、核酸代谢、染色体端粒结构的维持等重要的生物学过程,尤其是与一些疾病的发生和治疗有关。相比而言,ku基因在微生物中的研究还很初步,其功能还有待于进一步深入研究。 参 考 文 献

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