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原始的胚细胞经分化形成精原细胞,精原细胞经复制形成初级精母细胞,初级经母细胞经过第一次减数*后形成次级精母细胞,再经过第二次减数*形成精细胞。精细胞经过变形最终形成精子。指由*精子管上皮的原始生殖细胞经过多次有丝*而形成的细胞。精原细胞属于雄性生殖细胞的早期发育阶段,能不断地进行细胞*,增加细胞数量,并分化为精母细胞.精原细胞描述:贴近基膜,细胞呈圆形,核大而圆,梁色深。精原细胞在男性的一生中具有几乎是无限*的能力,而且*过程中能够保持原有的基因性状不变,这是令人惊奇的!
一、实验目的:
通过根尖压片法,掌握Feulgen反应显示DNA的基本原理和主要操作环节
二、实验原理:
Feulgen反应是1924年由Feulgen和Rossenbeck开创的。这一反应的原理是:DNA在一定的温度(60℃)下,被酸水解,打开嘌呤碱与脱氧核糖连接的键。在脱氧核糖的一端形成游离的醛基,醛基与Schiff试剂(脱色碱性品红)结合,形成紫红色化合物。所以,凡有DNA的部位,会呈现紫红色阳性反应,可以作为定性研究DNA的一种简便方法。
三、实验用品:
(一)、药品:
1、Schiff试剂:称1g碱性品红,溶于200ml已煮沸的蒸馏水中(要漫漫加入,不可一下全部倒入),继续煮沸5分钟(搅动),然后使其冷却至50℃,过滤于棕色磨口瓶中,加入20ml1N HCl(取比重为1•19的HCl 32•5ml,加蒸馏水至1000ml即成),继续冷却至25℃时加入1g偏亚硫酸钾(KHSO3)或偏亚硫酸钠(NaHSO3),将瓶塞盖严,置于暗处24小时,溶液应为无色,可保持在1-4℃冰箱中备用。如果红色不退可加入2g活性炭粉末,搅动数分钟后静置数小时,再过滤即可脱去红色。
2、1N HCl:取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入水中)。
3、45%醋酸
4、亚硫酸水溶液:在200ml自来水中,加入10ml 10%的偏亚硫酸钠(或偏亚硫酸钾)溶液,或加入10ml 30%的偏重亚硫酸钠溶液,再加入1N HCl 10ml即成,盖紧瓶塞。此液要现配现用。
5、Carnoy固定液:95%酒精3份,冰醋酸1份混合即可。
6、50%酒精、30%酒精。
7、5%三氯醋酸
(二)、用具:
显微镜、恒温水浴锅、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、酒精灯、青霉素小瓶、吸水纸等
四、实验材料:
大蒜、洋葱或蚕豆根尖
五、方法步骤:
1、取0•5-1cm的根尖,在carnoy固定液中固定2-24小时。固定时以冰箱中进行为宜。
2、取出固定材料,用50%酒精、30%酒精、蒸馏水各冲洗5分钟,以除掉材料上的醋酸。准备两张切片,其中一张作对照。
3、水解:用1N的冷HCl过洗材料一次,然后放入温度稳定在60℃的1N HCl中,水解10-14分钟,取出材料后再用1N冷HCl过一次。
4、染色:将水解后的材料放入Schiff试剂中染色1小时左右,此时根尖部分会出现紫红色。
5、用亚硫酸水漂洗三次,每次5分钟,使细胞质的紫红色退掉,再流水冲洗5—15分钟,洗后的材料放入蒸馏水中。
8、用45%的醋酸压片。
9、镜检。与对照装片比较。
10、对照切片的制做:进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片可用下面两种方法制作:○1不经水解直接放入schiff试剂内染色。○2 材料固定后用5%三氯醋酸于90℃处理15min,用蒸馏水冲洗,以后步骤同实验组。
六、注意事项:
1、Feulgen反应的染色深浅与材料、水解时的温度和时间都有关系。水解时间的长短要根据固定液和材料来进行选择,时间太短则游离的醛基量少而染色不深,时间太长会因醛基进一步变成其它物质,染色也不深。水解时的温度要严格控制。
2、未经水解的对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可),时间过长,试剂本身的酸性也会使DNA水解,从而出现假的正反应。
3、Schiff试剂的作用 :Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素,就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红,它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外,Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。
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这个主要和DNA超螺旋有关,我只能简单说一下楼主可以自己去看看相关书籍。
所谓超螺旋,是指双螺旋状DNA扭转后再进一步扭转。
大部分成熟的真核生物细胞都是分化产生的,这些不同的细胞含有同种基因却有不同的形态及功能,而产生这个的原因就是细胞中部分DNA紧密扭转缠绕形成超螺旋结构。这种结构的DNA因为缠绕紧密的缘故,几乎无法进行解旋也就没有办进行转录,也就无法产生相应的RNA。相反的那些没有高度缠绕的DNA,也就是放松状态下的DNA,就会表达出来。
精原细胞DNA小的原因大概有两个,其一是需要为变形成精子做准备(精子的体型非常小),其二就是上面说的关于超螺旋了。精原细胞并不需要像普通细胞那样进行繁琐的工作
它除了活动细胞的基本活动和变形准备之外几乎不用产生其他物质也不需要再*(*准备阶段的细胞核会显得很大,因为在进行DNA复制,而正常细胞在大多数时候都在进行*或者出于准备*的阶段)一些细胞,所需要表达出来的DNA相对较少,DNA挨得比较紧,然后就颜色又深又小了。
好了,以上是推论,楼主还是自己看书吧,如果有用的话要记得采纳。