重叠PCR的原理
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发布时间：2022-04-21 01:20
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热心网友
时间：2022-06-17 01:59
博凌科为-为你解答：比如两个基因，一个命名为a，一个命名为b。a的序列为5-atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，b的序列为5-atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计引物，假设引物的序列为：
a1:5-atgcatgctagctagaacgct-3a2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3b1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3b2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3我们的目的是将基因a,b通过pcr的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物a2和b1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这样呢？这就是我们在设计引物的时候在a2的3端加入了20个b基因5端的序列，在b1的5端加入了20个a基因3端的序列。我们来看重叠pcr的步骤：（1）以a1,a2扩增a基因，b1，b2扩增b基因（2）回收a，b基因（3）以a，b为共同的模板，a1和b2为引物，扩增a+b，这样我们就利用重组pcr的方法将a+b拼接起来了。为什么会扩出a＋b呢？因为我们在设计引物的时候使a，b有了20个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一起，因此可以扩增出a+b.第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板a，b，dntp，buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物a1和b2以及taq酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入pcr管，进行反应，好处是节省时间，不太麻烦。目前重叠pcr的应用十分广泛，比如说在基因的定点突变，虽然说现在有很多的突变试剂盒，应用起来也很简单，但那是需要银子的；人工合成基因，其实人工合成基因最基本的技术（目前应用最为广泛的）就是利用重叠pcr的方法；启动子与目的基因的串连；两个不同表达盒的连接，大家都知道我们在使用dna调取或者说扩增基因的时候，往往需要将几个表达盒串连起来观察他们的表达效果，但由于绝大多数的dna中都含有内含子，也就是说几个外显子并不是串连在一起的，而要想达到我们的目的，只要应用重叠pcr技术就可以轻松完成。
热心网友
时间：2022-06-17 01:59
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠*性内切酶消化的方法难以得到的产物.重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计.重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
