分子标记技术在甜瓜上的应用有哪些？
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发布时间：2022-04-22 04:56
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时间：2023-07-16 17:00
近年来，随着分子生物学的发展，直接在DNA水平上进行基因组差异分析的技术（RAPD、RFLP等）越来越受到重视。与蛋白质和同工酶分析相比，DNA分析的方法更能直接反映出研究对象的遗传信息，准确率高，稳定性好，目前，已广泛用于西瓜遗传基础的研究。
（一）遗传图谱的构建
Hashizume等（1996）利用一个近交系（H-7；C.lanatus）和一个野生类型（SA-1；C.lanatus）杂交获得的BC1群体构建了一个最初的西瓜分子遗传连锁图谱，该图谱包括58个RAPD标记，1个同工酶标记，1个RFLP标记和2个形态标记，分为11个连锁群，全长524cM。张仁兵等（2000）利用97103×PI296341杂交的F2群体构建了一个分子遗传图谱，包括85个RAPD标记，3个SSR标记，3个同工酶标记，4个形态标记及1个抗枯萎病生理小种1基因，覆盖基因组长度为1203.2cM。Hawkins等（2001）利用F2和F3群体构建了两张西瓜连锁图谱，分别包括26和13个标记（同工酶、RAPD、SSR），分布在2个和5个连锁群上、覆盖基因组长度分别为112.9cM和139cM。Levi等（2001）利用BC1群体[（PI296341-FR×NKM）×NKM（New Hampshire Midget）]构建了长达1295cM的遗传连锁图谱，包括155个RAPD标记和1个SCAR标记，分为17个连锁群，而后Levi等又利用一个测交群体构建了包括141个RAPD标记、27个ISSR标记和1个SCAR标记的分子遗传图谱，分为25个连锁群，全长1162.2cM。范敏等（2000）用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系97103和可溶性固形物含量低、皮厚、抗病的野生西瓜种质PI296341杂交所得F2的118个单株为作图群体，构建分子连锁图谱，定位了影响西瓜果实可溶性固形物含量的4个数量性状位点（QTL），果皮硬度的5个QTL，果皮厚度的2个QTL，单瓜重的3个位点，种子千粒重的6个位点。
然而，利用BC1或F2等非永久群体所构建的分子遗传图谱，无法继续将其饱和，难以准确地对其进行重要农艺性状的QTL定位，同时也无法与其他实验室合作进行比较研究。因此，采用永久群体如重组自交系与DH（单倍体加倍）群体进行分子遗传图谱的构建已经成为目前国际上图谱构建的主流方向。由于西瓜花药与小孢子培养比较困难，利用重组自交系来构建西瓜永久分子遗传图谱可能成为最有效的选择。张仁兵等（2003）用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系97103和可溶性固形物含量低、皮厚、抗病的野生西瓜种质PI296341杂交所得重组自交系F8的117个单株为作图群体，利用RAPD标记技术构建了西瓜分子遗传图谱。该图谱包含87个RAPD标记、13个ISSR标记和4个SCAR标记，分为15个连锁群，包括：1个最大的含31个标记的连锁群（277.5cM）、6个大的含4～12个标记的连锁群（51.7～172.2cM）和8个小的含2～5个标记的连锁群（7.9～46.4cM），覆盖基因组长度为1027.5cM，两个标记间的平均距离为11.54cM。该图谱为以后获得饱和的分子遗传图谱、重要农艺性状的QTL分析以及图谱克隆抗病基因奠定了坚实的基础。
西瓜是一种基因组小（约为4.3×105kb）、遗传差异狭窄的作物，以上分子标记主要是采用多态性较低、稳定性较差的RAPD标记，不能满足其分子遗传研究的需要。易克（2003）对97103×PI296341所获得的F8重组自交系群体，通过16个SSR和5个ISSR引物对该群体进行扩增，建立了一个包括38个SSR标记和10个ISSR标记组成的分子图谱，该图谱总长558.1cM，平均图距为11.9cM。易克（2004）又对97103×PI296341所获得的F2S7重组自交系群体，通过AFLP技术对该群体进行扩增，建立了一个包括150个标记组成的分子图谱，包括17个连锁群，覆盖基因组范围1240.2cM，两个标记间的平均图距为8.3cM。该图谱的建立对于西瓜高密度遗传图谱的构建、重要农艺性状的QTL定位以及重要基因的图谱克隆均具有重要的参考价值。
（二）遗传多样性及亲缘关系分析
西瓜的遗传背景相对狭窄，栽培种和野生种、种间多态性较高，品种之间多态性较低。Zhang XP等（1994）对3份栽培品种、1份栽培种的野生类型材料和1份栽培种与野生种的杂交种进行RAPD检测，53个引物在5份材料中产生的多态性为62.3%，而在3个栽培品种内的多态性带仅为10.1%，其平均遗传距离为0.240～0.263cM。韩国的Lee SL等（1996）对39份西瓜材料进行RAPD检测与聚类分析，发现其平均遗传距离的变动范围仅为0～0.366。赵虎基等（1999）对西瓜的RAPD标记多态性研究表明：14个引物在12份材料间共扩增出114条带，其中有81条具多态性，占总条带的71.1%。其中一份饲用西瓜、3份食用西瓜和8份籽用西瓜之间带型差异较大，说明亲缘较远；8个籽瓜之间和3个食用西瓜之间带型差异较小，说明亲缘较近。
李严等（2005）利用SRAP（Sequence-Related Amplified Po1ymorphism）进行了西瓜杂交种遗传多态性的研究，利用25个多态性引物组合对当前生产上推广的20个西瓜杂交种进行扩增，从中筛选得到20个多态性引物组合，*生135个多态性条带，平均每个引物组合产生7.11个多态性条带，显示了较高的多态性。聚类分析将20份材料分为3大类，Jaccard’s相似系数在0.29～0.86之间。
（三）杂种鉴定
欧阳新星等（1999）采用简化了的适合西瓜的RAPD-PCR分析程序，对无籽京欣1号西瓜种子纯度进行分子鉴定，找到了一个标记OPP01/5，其只在父本和杂交种上出现，母本中不出现，可用于鉴定该杂交种的品种纯度。
王鸣刚等（2003）以不同西瓜杂交种及亲本自交系为材料，研究利用RAPD技术鉴定西瓜杂种的纯度及种质的方法。结果表明：RAPD技术完全适合于西瓜杂交种纯度的早期鉴定及种质鉴定。引物OPD16及OPA07适合种内鉴定，而引物OPA10、OPA13、OPH18可用于杂种纯度鉴定。其中，引物OPA10/0（母本缺少）和OPA13/1140（母本缺少）、OPA13/750（父本缺少）可用来鉴定西农8号西瓜杂交种纯度；母本缺少的引物OPH03/350，OPH04/280和OPH18/620能用来鉴定兰州P2的杂交种纯度。
（四）分子标记辅助选择
许勇等（1998）运用RAPD技术进行了西瓜野生材料PI482322耐冷性基因的分子标记研究，找到了一个与耐冷基因连锁的分子标记OPG12/1950，其遗传距离为6.98cM。许勇等（1999）运用RAPD技术，采用混合分组分析（BSA）方法进行了西瓜野生种质PI296341抗枯萎病基因分子标记研究。结果表明：西瓜野生种质PI296341对枯萎病生理小种1的抗性由单显性基因控制，RAPD标记OPP01/700与其抗病基因连锁，其遗传距离为3.0cM。许勇等（2000）对RAPD标记OPP01/700进行了克隆、测序，Southern杂交证明此标记为单拷贝，并转化为SCAR标记。上述技术在抗病转育后代中得到了很好的应用，初步建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择系统。
刘海河等（2004）利用RAPD技术对西瓜G17AB雄性不育系的不育株和可育株基因组DNA进行了比较分析，在31套621个RAPD引物中，有548个引物在两者之间获得扩增产物，筛选到了可育株与不育株的特异扩增条带A123K（分子量约为3.0kb，序列为5’-TCGGCGATAG-3’）片段，经多次重复验证，表现稳定的多态性。用该引物对单个不育株后代育性分离群体进行了RAPD分析，确定了A123K与育性基因的遗传距离为8.1cM。
张显等（2005）应用RAPD分子标记技术，采用BSA法对西瓜隐性核不育材料Se18的不育基因进行了分子标记研究。结果表明：在220个引物中，只有引物S1167（序列为ACCACCCGCT）、S357（序列为ACGCCAGTTC）在不育株DNA中扩增出了多态性特异片段，而在可育株DNA中未扩增出多态性片段。验证结果表明：引物S1167在12个不育材料中的138个不育株全部扩增出特异性片段，可以区分不育株与可育株。对特异性片段进行回收、克隆和测序结果表明，S1167扩增特异片段有2391个碱基对。
